rADTZ在大肠杆菌中的可溶性融合表达、纯化及其圆二色性分析

论文摘要

黄曲霉毒素是一类强致癌诱变剂，其毒性大，稳定性高，对人类和动物的危害较大，其中黄曲霉毒素B1是毒性最强的一种。该毒素的转化、去毒一直是受到关注的问题。本研究所长期从事黄曲霉毒素生物去毒转化的研究，筛选到一株产黄曲霉毒素解毒酶的菌株E-20。目前已运用基因工程技术获得了该黄曲霉毒素解毒酶基因的全长cDNA序列，并实现了其在甲醇诱导的毕赤酵母系统中的分泌表达。由于ADTZ在毕赤酵母中表达发酵时间周期长、需要精确控制发酵和表达量的提高难度大等问题，为了更简便的获得纯酶用于进一步的研究与应用，本工作将黄曲霉毒素解毒酶基因的ORF克隆到含有融合标签MBP的pMAL—C2X载体上，构建原核重组表达质粒pMAL—C2X—ADTZ，将其导入大肠杆菌Rosetta（DE3），IPTG诱导实现了MBPADTZ融合蛋白的高效表达，表达产物经Western blot检测在118KD分子量处有一明显的特异杂交带。在诱导温度为37℃时，MBPADTZ融合蛋白为包涵体表达，当降低诱导温度至20℃时，MBPADTZ融合蛋白绝大部分为可溶性表达，通过IPTG浓度、IPTG加入时机和诱导时间的优化后，其融合蛋白的表达量可达到0.64g／L,按分子量比例推算出rADTZD蛋白的理论表达量为0.45g／L。细胞裂解物经Amylose亲和层析后得到电泳纯的单一融合表达产物。该融合蛋白经Factor Xa酶切裂解后，得到分子量分别约为42KD的MBP蛋白和76KD的rADTZ蛋白。酶切裂解产物经Phenyl Sepharose 6 Fast Flow疏水层析后得到单一纯度的rADTZ蛋白，其获得量为0.397g／L。对rADTZ蛋白进行生物学活性测定，结果表明rADTZ蛋白具有降解AFB1的酶活性，其去毒率达到了19.66％，酶比活为26.25U／g。圆二色光谱对rADTZ蛋白二级结构的分析结果为：a—螺旋为43.3％、β-折叠为31.1％、B—转角为10.5％和无规则卷曲为15.1％。本研究成功构建了原核重组质粒pMAL—C2X—ADTZ，实现了rADTZ在Rosetta（DE3）中的高效表达。细胞裂解物经Amylose亲和层析、Factor Xa酶切和Phenyl Sepharose 6 Fast Flow疏水层析后得到电泳纯的rADTZ蛋白。原核表达的rADTZ蛋白具有降解AFB1的酶活性。圆二色性分析结果表明：rADTZ含a—螺旋和β-折叠的理论推导值与实验值相符。本工作为探讨原核表达黄曲霉毒素解毒酶的可行性做了重要的基础工作。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略词表
• 目录
• 第一章 前言
• 1.1 黄曲霉毒素的简介
• 1.1.1 黄曲霉毒素的理化特性
• 1.1.2 黄曲霉毒素的生物合成
• 1.1.3 黄曲霉毒素的危害
• 1.2 黄曲霉毒素去毒化的研究进展
• 1.2.1 物理化学去毒
• 1.2.2 生物学去毒
• 1.2.2.1 添加微生物菌体制剂
• 1.2.2.2 酶法去毒
• 1.3 大肠杆菌原核表达系统
• 1.3.1 新生肽折叠与包涵体的形成
• 1.3.2 重组蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达策略
• 1.3.2.1 分子伴侣的使用
• 1.3.2.2 融合蛋白的应用
• 1.3.2.3 折叠酶的共表达
• 1.3.2.4 优化培养及表达条件
• 1.3.2.5 选择适合的菌株
• 1.3.2.6 化学物质的加入
• 1.3.2.7 氨基酸的替代
• TM蛋白质融合与纯化系统'>1.4 pMAL^TM蛋白质融合与纯化系统
• 1.5 圆二色谱在结构生物学研究中的应用
• 1.6 研究背景与思路
• 第二章 实验设备及材料
• 2.1 主要仪器设备
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 菌种与质粒
• 2.2.2 酶类
• 2.2.3 试剂盒
• 2.2.4 分子量参照物
• 2.2.5 常用试剂
• 2.2.6 培养基&其他试剂
• 第三章 实验方法
• 3.1 pMAL—C2X—ADTZ重组质粒的构建、转化与表达
• 3.1.1 目的片段ADTZ与载体pMAL—C2X的制备
• 3.1.1.1 扩增提取含有目的基因的质粒
• 3.1.1.2 PCR扩增目的基因
• 3.1.1.3 琼脂糖凝胶电泳观察PCR产物
• 3.1.1.4 DNA快速回收试剂盒回收PCR产物
• 3.1.1.5 单酶切PCR产物
• 3.1.1.6 扩增提取载体质粒pMAL-C2X
• 3.1.1.7 分步单酶切载体pMAL—C2X
• 3.1.1.7.1 XmnI单酶切载体pMAL—C2X
• 3.1.1.7.2 BamHI单酶切载体pMAL—C2X片段
• 3.1.2 重组质粒pMAL—C2X—ADTZ的构建及克隆
• 3.1.2.1 载体pMAL—C2X与ADTZ片段的连接
• 3.1.2.2 TOP10F’感受态细胞的制备、转化
• 3.1.2.3 PCR和双酶切鉴定重组质粒pMAL—C2X—ADTZ
• 3.1.2.4 重组质粒测序
• 3.1.3 pMAL—C2X—ADTZ重组质粒转化Rosetta（DE3）
• 3.1.3.1 Rosetta（DE3）感受态细胞的制备、转化
• 3.1.3.2 菌落PCR鉴定Rosetta（DE3）—pMAL—C2X—ADTZ重组子
• ADTZ融合蛋白的诱导表达'>3.1.4 MBP_ADTZ融合蛋白的诱导表达
• 3.1.4.1 重组菌的诱导表达
• 3.1.4.2 SDS-PAGE检测表达产物
• ADTZ融合蛋白的可溶性分析'>3.1.4.3 MBP_ADTZ融合蛋白的可溶性分析
• 3.1.4.4 蛋白含量的测定
• 3.1.4.5 表达条件优化
• 3.1.4.5.1 诱导温度的探索
• 3.1.4.5.2 IPTG浓度的探索
• 3.1.4.5.3 IPTG加入时机的探索
• 3.1.4.5.4 诱导时间的探索
• ADTZ融合蛋白的Western blot分析'>3.2 MBP_ADTZ融合蛋白的Western blot分析
• ADTZ融合蛋白的亲和层析'>3.3 MBP_ADTZ融合蛋白的亲和层析
• ADTZ融合蛋白的酶切'>3.4 MBP_ADTZ融合蛋白的酶切
• ADTZ融合蛋白的时间选择'>3.4.1 1%（质量比）Factor Xa酶切MBP_ADTZ融合蛋白的时间选择
• ADTZ融合蛋白最佳浓度的选择'>3.4.2 Factor Xa酶切MBP_ADTZ融合蛋白最佳浓度的选择
• 3.5 酶切产物的柱层析分离纯化
• 3.5.1 酶切产物的DEAE柱层析
• 3.5.2 酶切产物的G—75柱层析
• 3.5.3 酶切产物的Phenyl Sepharose 6 Fast Flow疏水柱层析
• 3.6 rADTZ生物活性的测定
• 1高效薄层层析（HPTLC）检测法'>3.6.1 AFB₁高效薄层层析（HPTLC）检测法
• 1荧光扫描法'>3.6.2 AFB₁荧光扫描法
• 3.7 rADTZ的圆二色性分析
• 第四章 实验结果
• 4.1 pMAL—C2X—ADTZ重组质粒的构建、转化与表达
• 4.1.1 PCR扩增目的基因和单酶切载体pMAL—C2X
• 4.1.2 BamHI单酶切ADTZ片段和pMAL—C2X片段
• 4.1.3 重组质粒pMAL—C2X—ADTZ的PCR和酶切鉴定
• 4.1.4 TOP10F'—pMAL—C2X—ADTZ测序结果
• 4.1.5 TOP10F'—pMAL—C2X—ADTZ的测序结果去除载体序列分析
• 4.1.6 菌落PCR鉴定Rosetta（DE3）—pMAL—C2X—ADTZ重组子
• ADTZ融合蛋白的诱导表达结果'>4.1.7 MBP_ADTZ融合蛋白的诱导表达结果
• ADTZ融合蛋白的可溶性分析'>4.1.8 MBP_ADTZ融合蛋白的可溶性分析
• 4.1.9 MBP ADTZ融合蛋白在Rosetta（DE3）中表达条件的优化
• 4.1.9.1 最佳诱导温度的选择
• 4.1.9.2 IPTG浓度的选择
• 4.1.9.3 IPTG加入时机的选择
• 4.1.9.4 不同的诱导时间
• 4.2 Western blot鉴定融合蛋白MBP ADTZ
• ADTZ融合蛋白亲和层析纯化结果'>4.3 MBP_ADTZ融合蛋白亲和层析纯化结果
• ADTZ融合蛋白的酶切结果'>4.4 MBP_ADTZ融合蛋白的酶切结果
• ADTZ融合蛋白的时间选择结果'>4.4.1 1%（质量比）Factor Xa酶切MBP_ADTZ融合蛋白的时间选择结果
• ADTZ融合蛋白最佳浓度选择结果'>4.4.2 Factor Xa酶切MBP_ADTZ融合蛋白最佳浓度选择结果
• 4.5 酶切产物的柱层析分离纯化
• 4.5.1 酶切产物的DEAE柱层析结果
• 4.5.2 酶切产物的G—75柱层析结果
• 4.5.3 酶切产物的Phenyl Sepharose 6 Fast Flow疏水柱层析结果
• 4.6 rADTZ生物活性的测定结果
• 1高效薄层层析（HFTLC）检测结果'>4.6.1 AFB₁高效薄层层析（HFTLC）检测结果
• 1荧光扫描结果'>4.6.2 AFB₁荧光扫描结果
• 4.7 rADTZ的圆二色性分析结果
• 第五章 分析与讨论
• 5.1 pMAL—C2X载体表达系统的特点
• ADTZ融合蛋白在Rosetta（DE3）中表达条件的优化'>5.2 MBP_ADTZ融合蛋白在Rosetta（DE3）中表达条件的优化
• 5.3 酶切产物的柱层析分离纯化
• 5.4 rADTZ蛋白的生物学活性检测及圆二色性分析
• 第六章 小结与展望
• 附录1
• 附录2
• 附录3
• 附录4
• 参考文献
• 致谢