重组大肠杆菌产嘌呤核苷磷酸化酶发酵条件的优化

论文摘要

本文研究了培养基组成对大肠杆菌BL2 1发酵生产PNPase的影响,重点研究了复合培养基及合成培养基的影响。在复合培养基中,C/N比3：1为菌体生长及蛋白表达的最优碳氮比,K离子对菌体生长、目的蛋白含量及发酵液酶活有明显促进作用,有机氮无机氮比例的变化对菌体生长无明显影响,但对蛋白表达影响较大,呈现出有机氮越少,蛋白表达越差的趋势。在合成培养基中,微量元素是实现高密度培养必不可少的,菌体生长及蛋白表达的最优碳氮比为10：1。在复合培养基和合成培养基的对比中发现,两种培养基最优碳氮比条件下菌体生长相近,但蛋白表达相差较大。考虑到有机氮无机氮的差异造成的,故以有机氮无机氮为着眼点进行了对比,发现无机氮是高密度培养中不可或缺的,无无机氮时大肠杆菌无法高密度生长,随之目的蛋白的高表达也不能达到。有了无机氮菌体生长不受影响,但必须有合适量的有机氮（有机氮无机氮比合理）才能实现重组蛋白的高表达。为深入研究营养（特别是氮源）供给与菌体生长蛋白表达的关系,建立了分析细胞内关键代谢物α-酮戊二酸的方法。在此基础上监控了不同培养基条件下α-酮戊二酸含量的变化,结果表明α-酮戊二酸可以通过自身的变化（积累或维持一定水平）来反映营养条件（相对缺乏或丰富）的变化,也验证了John A and Jeremy Aα-酮戊二酸是氮源调节信号分子的结论。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 1.1 PNPase研究背景
• 1.1.1 PNPase的结构及氨基酸组成
• 1.1.2 PNPase的医学价值
• 1.2 重组大肠杆菌高密度培养技术
• 1.2.1 影响大肠杆菌高密度培养的主要因素
• 1.2.2 培养技术
• 1.2.3 提高E.coli高密度生长的分子策略
• 1.3 微生物基本营养
• 1.3.1 碳源
• 1.3.2 氮源
• 1.3.3 能源与水
• 1.3.4 矿质元素与生长因子
• 1.4 有关营养调节机制
• 1.4.1 细菌中的氮源调节
• 1.4.2 细菌的应急反应/紧缩响应
• 1.5 离子对色谱法
• 1.5.1 高效液相色谱简介
• 1.5.2 离子对色谱法原理
• 1.5.3 离子对试剂的选择
• 1.6 本文研究目的及内容
• 第2章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 培养基及培养条件
• 2.1.3 实验试剂及器材
• 2.1.4 实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 发酵流程
• 2.2.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.2.3 PNPase酶活的测定
• 第3章 发酵过程参数优化
• 3.1 溶氧水平的影响
• 3.1.1 DO对菌体生长的影响
• 3.1.2 DO对蛋白含量的影响
• 3.1.3 DO对发酵液酶活的影响
• 3.2 溶氧水平与限制性底物之间的关系
• 3.3 小结
• 第4章 复合培养基的研究
• 4.1 培养基结构的影响
• 4.1.1 碳氮比对菌体生长的影响
• 4.1.2 不同C/N比对蛋白含量的影响
• 4.1.3 不同C/N比对发酵液酶活的影响
• 4.2 无机盐的影响
• 4.2.1 K、Na、Ca、P浓度对菌体生长的影响
• 4.2.2 K、Na、Ca、P浓度对蛋白含量的影响
• 4.2.3 K、Na、Ca、P浓度对发酵液酶活的影响
• 4.3 有机氮无机氮比的影响
• 4.3.1 有机氮无机氮比对菌体生长的影响
• 4.3.2 有机氮无机氮比对蛋白含量的影响
• 4.3.3 有机氮无机氮比对发酵液酶活的影响
• 4.4 小结
• 第5章 合成培养基的研究
• 5.1 合成培养基的初步优化
• 5.1.1 微量元素的影响
• 5.1.2 不同碳氮比的影响
• 5.1.3 主要矿质元素的影响
• 5.2 复合培养基与合成培养基的比较
• 5.2.1 碳氮比的比较
• 5.2.2 有机氮无机氮的比较
• 5.3 本章小结
• 第6章 基于细胞内关键代谢物的研究
• 6.1 离子对色谱法分离细胞内α-酮戊二酸
• 6.1.1 代谢物的灭活
• 6.1.2 抽提方法的选择
• 6.1.3 色谱分析柱的选择
• 6.1.4 柱温及波长的选择
• 6.1.5 流动相的选择
• 6.1.6 α-酮戊二酸的标准曲线
• 6.1.7 目标物侧面确证实验
• 6.1.8 稳定性实验
• 6.1.9 精密度实验
• 6.1.10 回收率实验
• 6.2 不同营养条件下发酵过程α-酮戊二酸含量变化
• 6.2.1 复合培养基条件下发酵过程AKG变化
• 6.2.2 合成培养基条件下发酵过程AKG变化
• 6.2.3 基于不同培养基下α-酮戊二酸变化的分析
• 6.3 小结
• 第7章 结论与展望
• 7.1 结论
• 7.2 展望
• 参考文献
• 致谢