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猪霍乱沙门氏菌C500株crpˉ、asdˉ缺失株平衡致死系统的构建及应用

2020-11-22阅读(557)

猪霍乱沙门氏菌C500株crpˉ、asdˉ缺失株平衡致死系统的构建及应用

论文摘要

猪霍乱沙门氏菌（Salmonella Choleraesuis）是导致2-4月龄仔猪副伤寒的主要病原，过去曾是危害我国养猪业的主要疾病之一，现在在我国特别是农村散养户普遍存在，造成一定经济损失。动物生前感染沙门氏菌或其产品受到污染，可使人发生食物中毒，因此该病原在公共卫生上也具有重要意义。疫苗接种是控制猪霍乱的最适宜手段。猪霍乱沙门氏菌C500株是用化学方法致弱、用于预防仔猪副伤寒的弱毒疫苗株，虽具有较好的免疫原性，但具有一定的残余毒力，遗传背景不清，且存在毒力返强的风险。 粘膜免疫与多价疫苗是未来免疫预防传染病的主要方向。沙门氏菌作为疫苗载体已受到医学与兽医学的广泛重视，其主要优点包括沙门氏菌可以经粘膜途径免疫（口服或鼻内），操作方便，对接种对象刺激小。此外，沙门氏菌为胞内侵袭细菌，能有效呈递抗原，激发抗沙门氏菌和诱导外源蛋白的特异性体液与细胞免疫反应，并能同时诱导粘膜免疫与全身免疫。但目前所构建的沙门氏菌载体多为鼠伤寒沙门氏菌。以猪霍乱沙门氏菌为载体的报道很少。而猪水肿病（Edema disease of swine，ED）是由某些血清型的E．coli引起的，主要发生在断乳后1—2周的仔猪，是危害断奶仔猪较严重的疾病之一。SLT—Ⅱv毒素是致水肿病的主要致病因子，由1个A亚基和5个B亚基共同组成的聚合体。A亚基为毒素的毒力部分，B亚单位决定毒素的特异性，也是毒素的主要免疫原性部分。 基于以上考虑，本研究旨在研制更加安全的猪霍乱沙门氏菌弱毒株，并将C500开发为适于粘膜免疫的疫苗活载体。以C500为亲本菌，在基因组上缺失编码cAMP受体蛋白的crp（cAMP receptor protein）基因，以降低C500毒力，消除毒力返强的风险。进一步缺失编码天冬氨酸β-半乳糖脱氢酶的asd（aspartate beta-semialdehyde）基因，构建asd平衡致死系统，用于高效表达外源基因，初步应用该载体表达了绿荧光蛋白基因（Green fluorescence protein，gfp）和致水肿大肠杆菌水肿毒素B亚基（Shiga-like toxin type Ⅱ variant B，SLT-ⅡvB），并进行了小鼠免疫试验，为研制仔猪副伤寒—猪水肿病新型二联疫苗奠定基础。主要研究内容包括： 1．crp、asd基因的克隆与重组自杀性质粒的构建 参照GenBank中鼠伤寒沙门氏菌LT2株crp及asd序列，以C500基因组为模板扩增并克隆crp与asd基因。测序及序列比对分析证实，两基因与已发表的其它3株沙门氏菌crp、asd基因全序列高度同源。从C500基因组中扩增crp及asd上下游片断，连接到自杀性质粒pRE112上，分别构建了缺失320bp的crp基因缺失320bp，插入gfp的crp缺失，以及缺失1408bp的asd基因缺失1408bp，并携带蔗糖敏感基因（sacB）的重组自杀性质粒pREcrp、pREcrpgfp和pREasd。 2．接合转移与C500crp-、C500crp-／gfp+、C500crp-／asd-、C500crp-／gfp+／asd-、C500asd-缺失株的筛选鉴定

论文目录

  • 目录
  • 摘要
  • Abstract
  • 缩略词表（Abbreviation）
  • 第1章 文献综述
  • 1.1 减毒沙门氏菌疫苗的研究进展
  • 1.1.1 经典的沙门氏菌疫苗
  • 1.1.2 新型沙门氏菌减毒疫苗
  • 1.1.3 想的减毒疫苗
  • 1.2 减毒沙门氏菌载体的研究进展
  • 1.2.1 减毒沙门氏菌载体的优点
  • 1.2.2 减毒沙门氏菌载体的缺点与解决方法
  • 1.2.3 选择标记的使用
  • 1.2.4 DNA疫苗载体
  • 1.2.5 减毒沙门氏菌载体在国内的应用
  • 1.3 猪霍乱沙门氏菌的危害与防制
  • 1.3.1 病原学
  • 1.3.2 流行病学
  • 1.3.3 发病机制
  • 1.3.4 临床症状
  • 1.3.5 病理变化
  • 1.3.6 诊断
  • 1.3.7 预防措施
  • 1.3.8 治疗
  • 1.4 猪霍乱沙门氏菌疫苗及载体的研究进展
  • 1.4.1 国外研究进展
  • 1.4.2 国内研究进展
  • 第2章 研究目的与意义
  • 第3章 材料与方法
  • 3.1 实验材料
  • 3.1.1 质粒、菌株和培养条件
  • 3.1.2 工具酶和试剂
  • 3.1.3 主要培养基及其配制
  • 3.1.4 缓冲液
  • 3.1.5 细菌基因组DNA提取试剂
  • 3.1.6 实验动物
  • 3.1.7 引物
  • 3.2 实验方法
  • 3.2.1 沙门氏菌基因组DNA提取
  • 3.2.2 PCR或酶切产物的回收与纯化
  • 3.2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法）
  • 3.2.4 连接产物的转化
  • 3.2.5 重组质粒的快速鉴定
  • 3.2.6 重组质粒的酶切鉴定
  • 3.2.7 质粒的制备
  • 3.2.8 沙门氏菌电转化
  • 3.2.9 沙门氏菌ELISA检测方法的建立
  • 3.2.10 大肠杆菌原核表达
  • 3.2.11 沙门氏菌属的PCR鉴定
  • 3.2.12 猪霍乱沙门氏菌C500株crp及asd基因的克隆与鉴定
  • 3.2.13 重组自杀性质粒pREcrp、pREcrpgfp、pREasd的构建
  • -、C500crp-/gfp+、C500crp-/asd、C500crp-/gfp+/asd、C500asd缺失株的筛选鉴定'>3.2.14 接合转移与C500crp-、C500crp-/gfp+、C500crp-/asd、C500crp-/gfp+/asd、C500asd缺失株的筛选鉴定
  • -缺失株生物学特性鉴定'>3.2.15 C500crp-缺失株生物学特性鉴定
  • -缺失株对小鼠的免疫试验'>3.2.16 C500crp-缺失株对小鼠的免疫试验
  • -缺失株对小鼠的攻毒保护试验'>3.2.17 C500crp-缺失株对小鼠的攻毒保护试验
  • 3.2.18 绿荧光蛋白基因gfp在沙门氏菌中的表达
  • -/asd缺失株中的表达'>3.2.19 致水肿病大肠杆菌水肿毒素B亚基（SLT-Ⅱ vB）在C500crp-/asd缺失株中的表达
  • 第4章 结果与分析
  • 4.1 crp、asd基因的克隆与序列分析
  • 4.1.1 crp基因的克隆与序列分析
  • 4.1.2 asd基因的克隆与序列分析
  • 4.2 重组自杀性质粒pREcrp、pREcrpgfp、pREasd的构建
  • 4.2.1 重组自杀性质粒pREcrp的构建
  • 4.2.2 重组自杀性质粒pREcrpgfp的构建
  • 4.2.3 重组自杀性质粒pREasd的构建
  • -、C500crp-/gfp+、C500crp-/asar、C500crp-/gfp+/asar、C500asd缺失株的筛选与鉴定'>4.3 C500crp-、C500crp-/gfp+、C500crp-/asar、C500crp-/gfp+/asar、C500asd缺失株的筛选与鉴定
  • -缺失株的筛选与鉴定'>4.3.1 C500crp-缺失株的筛选与鉴定
  • -/gfp+缺失株的筛选与鉴定'>4.3.2 C500crp-/gfp+缺失株的筛选与鉴定
  • -/asd、C500crp-/gfp+/asd、C500asd缺失株的筛选与鉴定'>4.3.3 C500crp-/asd、C500crp-/gfp+/asd、C500asd缺失株的筛选与鉴定
  • -缺失株生物学特性鉴定'>4.4 C500crp-缺失株生物学特性鉴定
  • -缺失株表型鉴定'>4.4.1 C500crp-缺失株表型鉴定
  • -缺失株生长特征鉴定'>4.4.2 C500crp-缺失株生长特征鉴定
  • -缺失株对小鼠的毒力试验'>4.4.3 C500crp-缺失株对小鼠的毒力试验
  • -缺失株对小鼠的免疫试验'>4.5 C500crp-缺失株对小鼠的免疫试验
  • -缺失株对小鼠的保护试验'>4.6 C500crp-缺失株对小鼠的保护试验
  • -/asd缺失株中的表达'>4.7 gfp在C500及C500crp-/asd缺失株中的表达
  • 4.7.1 gfp的克隆
  • -/asd缺失株中的表达'>4.7.2 gfp在C500及C500crp-/asd缺失株中的表达
  • -/asd缺失株中的表达'>4.8 SLT-Ⅱ vB在C500crp-/asd缺失株中的表达
  • 4.8.1 SLT-Ⅱ vB的克隆
  • -/asd缺失株中的表达'>4.8.2 SLT-Ⅱ vB在C500crp-/asd缺失株中的表达
  • -/asd （pYASLTⅡB）对小鼠的免疫试验'>4.8.3 重组菌C500crp-/asd （pYASLTⅡB）对小鼠的免疫试验
  • -/asd （pYASLTⅡB）诱导小鼠的DTH反应'>4.8.4 重组菌C500crp-/asd （pYASLTⅡB）诱导小鼠的DTH反应
  • -/asd （pYASLⅡIB）诱导小鼠的免疫保护反应'>4.8.5 重组菌C500crp-/asd （pYASLⅡIB）诱导小鼠的免疫保护反应
  • 第5章 讨论与结论
  • 5.1 crp缺失对毒力及免疫原性的影响
  • 5.2 重组自杀性质粒介导基因整合的筛选鉴定
  • -/gfp+缺失株染色体中的表达效率'>5.3 外源基因在C500crp-/gfp+缺失株染色体中的表达效率
  • -/asd缺失株平衡致死系统中的表达'>5.4 gfp基因在C500crp-/asd缺失株平衡致死系统中的表达
  • -/asd缺失株平衡致死系统中的表达'>5.5 SLT-Ⅱ vB基因在C500crp-/asd缺失株平衡致死系统中的表达
  • -/asd （pYASLTⅡB）对小鼠的免疫试验'>5.6 重组菌C500crp-/asd （pYASLTⅡB）对小鼠的免疫试验
  • 5.7 结论
  • 参考文献
  • 致谢

    • 相关论文文献

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