特用玉米体细胞再生和遗传多态性研究

论文摘要

组织培养及植株再生是植物基因工程的一个关键环节,对于作物改良具有重要意义。组织培养技术在玉米转基因育种中越来越受到重视,而其培养能力又受遗传因素的控制,因而了解并掌握玉米组织培养能力的遗传规律已成为当务之急。本研究利用以甜玉米为主的30 种玉米基因型的不同外植体进行组织培养,考察其体细胞再生能力的差异,并建立合适的再生体系,然后根据禾谷类作物基因组存在共线性的原理,利用与水稻再生能力相关的OS22A 的cDNA 序列设计引物,对24 种不同基因型玉米的DNA 进行扩增、电泳和软件分析,以期在基因组水平上对玉米再生能力的遗传特性进行分析并予以一定的解释。主要结果如下:1.对30种玉米不同基因型的成熟胚进行离体培养,筛选得到培养性较好的基因型TD08、田园花和田园穗等。实验结果表明:成熟胚的愈伤可诱导能力较为普遍,但诱导频率因基因型的不同有很大差异,不同基因型所诱导出的愈伤质量也有所不同。2. MS、N6两种基本培养基对成熟胚出愈率的高低影响不大;不同的生长调节物质对成熟胚愈伤组织生长状况有明显的影响,脯氨酸的添加对愈伤组织质量有促进作用;细胞分裂素对愈伤组织的质量和长势均有一定的负面影响。3. 以甜玉米为主的13种基因型的幼胚为材料,对其愈伤组织诱导,继代培养和分化进行系统的研究,并与成熟胚作比较。结果表明:玉米的成熟胚和幼胚愈伤诱导率密切相关,相关系数0.9653;玉米的成熟胚和幼胚的分化率也密切相关,相关系数0.9143,而幼胚的分化率与其出愈率的相关系数仅为0.4,可能与出愈率和分化率在遗传上不完全受同一系统的控制有关。两种胚诱导出的愈伤组织状态明显不同,幼胚诱导出的愈伤组织状态普遍比成熟胚的好;两种胚的愈伤分化率差异明显,成熟胚愈伤组织最高分化率为2.5%,幼胚愈伤组织最高分化率可达83.3% 。4.在茎尖再生体系建立的过程中,不同培养基上外植体丛生芽发生的方式和芽尖倍增数均不同。生长素/细胞分裂素的比值较大则促进茎尖产生愈伤组织,反之则有利于丛生芽的发生。不同培养基上的芽尖倍增数差异也很大,芽尖倍增数最多可达7-8个/茎尖（23号培养基）,最少只有1-2个/茎尖（22号培养基）。5.利用与水稻再生能力有关的表达序列OS22A设计引物,从中选出7对引物在23份玉米材料共检测到144条多态性条带,平均每个引物可扩出20.57条谱带（变化范围8-40个）。6.根据甜玉米幼胚再生能力的表型数据分别对23 材料进行聚类,将供试的材料划分为三个群,第一群出愈率、分化率均较高;第二群特点是出愈率较高,分化率很低或为零;第三群出愈率和分化率均较低。7. 利用各引物检测到的多态性位点对23 份甜玉米分别进行遗传多态性分析并聚类,所划分的群与根据再生能力表型数据所划分的群体不一致,认为水稻再生能力相关的基因表达序列在玉米中共线性的问题还有待深入研究。

论文目录

• 第一章 文献综述
• 1.1 玉米组织培养发展概况
• 1.2 玉米愈伤组织类型和再生途径
• 1.3 影响愈伤组织诱导的因素
• 1.3.1 基因型对玉米体细胞再生能力的影响
• 1.3.2 不同外植体对玉米再生的影响
• 1.3.3 培养条件对玉米体细胞再生能力的影响
• 1.3.3.1 基本培养基对愈伤组织的诱导和植株再生的影响
• 1.3.3.2 激素对愈伤组织的诱导和植株再生的影响
• 1.3.3.3 其它添加剂对愈伤组织的诱导和植株再生的影响
• 1.4 存在的问题及解决的办法
• 1.4.1 愈伤组织的改良
• 1.4.1.1 继代对愈伤组织改良的影响
• 1.4.1.2 温度对愈伤组织改良的影响
• 1.4.2 试管苗的移栽
• 1.4.3 污染
• 1.4.4 褐化
• 1.5 玉米再生能力的遗传特性及其基因效应分析
• 1.6 玉米比较基因组学
• 1.7 本研究的目的和意义
• 第二章 特用玉米再生力的评价及其再生体系的建立
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 方法
• 2.1.2.1 外植体的获得
• 2.1.2.2 培养基
• 2.1.2.3 愈伤组织的继代及改良
• 2.1.2.4 愈伤组织的再生
• 2.1.2.5 再生苗的生根及移栽
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 玉米成熟胚组织培养
• 2.2.1.1 基因型对成熟胚愈伤质量及诱导率的影响
• 2.2.1.2 培养基对愈伤组织诱导及生长的影响
• 2.2.2 玉米幼胚组织培养以及和成熟胚组织培养反应性的比较
• 2.2.2.1 幼胚和成熟胚培养愈伤诱导率的影响比较
• 2.2.2.2 幼胚与成熟胚培养愈伤组织状态比较
• 2.2.2.3 成熟胚与幼胚的分化和植株再生比较
• 2.2.3 茎尖再生体系的建立
• 2.3 讨论
• 2.4 结论
• 第三章 特用玉米再生能力及多态性分析
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.1.2.1 DNA 提取与纯化
• 3.1.2.2 引物的设计
• 3.1.2.3 PCR 扩增
• 3.1.2.4 扩增产物的检测
• 3.1.2.5 数据分析方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 反应体系的建立
• 2+浓度'>3.2.1.1 Mg²+浓度
• 3.2.1.2 Taq 酶
• 3.2.1.3 退火温度
• 3.2.1.4 反应体系的确立
• 3.2.2 引物的筛选
• 3.2.3 二十三份材料的类群划分
• 3.3 讨论
• 3.4 下一步研究建议
• 3.5 结论
• 附录
• 付图
• 参考文献
• 符号和缩略语
• 致谢
• 作者简介