缺氧对卵巢癌细胞株SKOV3细胞生物学行为的影响及其相关机制

论文摘要

目的：通过卵巢癌细胞系体外实验，研究缺氧／复氧后，卵巢浆液性囊腺癌细胞株SKOV3的细胞生物学行为改变，及其与缺氧诱导因子1α（hypoxia induciblefactor 1α，HIF-1α）表达变化的关系；探讨缺氧后SKOV3细胞E-钙粘蛋白（E-cadherin，E-cad）表达的改变及其机制；并了解HIF-1α与SNAIL基因间的相互调控关系。实验分三部分进行。第一部分材料与方法：体外常规培养、传代卵巢浆液性囊腺癌细胞株SKOV3。分别缺氧24h，缺氧24h后复氧培养24、48h。采用MTT法检测细胞增殖情况，采用流式细胞仪检测细胞周期；采用transwell法检测细胞侵袭能力，采用明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶活性，采用RT-PCR检测缺氧／复氧后不同时间基质金属蛋白酶2（MMP2）的mRNA表达变化；采用RT-PCR检测缺氧／复氧后不同时间HIF-1α和SNAIL基因的mRNA表达，采用western blot检测HIF-1α的蛋白表达。用HIF-1α抑制剂Rapamycin预处理细胞30分钟后，检测上述细胞处理后的生物学行为的变化，探讨此生物学行为变化的可能机制。结果：缺氧／复氧后卵巢癌细胞SKOV3的增殖能力增强。缺氧后复氧24h细胞增殖率（1.38±0.60）增加，与对照组（0.57±0.11）棚比有统计学差异（P=0.023，P＜0.05）；复氧48h后，增殖率恢复为常氧培养水平（0.67±0.28，P=0.48）。流失细胞仪分析显示复氧24h内S期细胞所占比例（48.45±1.15％）较对照组（36.61±3.24％）相比显著增加（P=0.013）。Rapamycin可以使细胞周期停滞于G0-G1期从而降低细胞的增殖能力。明胶酶谱和Transwell的结果显示缺氧／复氧后肿瘤细胞的侵袭能力增强。RT-PCR检测发现缺氧／复氧后SKOV3细胞的SNAIL和MMP2表达增强。HIF～1α抑制剂rapamycin不能抑制缺氧／复氧后SKOV3细胞的侵袭能力增加，rapamycin可以抑制SNAIL基因的表达，但不能改变MMP2mRNA的表达。常规培养的SKOV3稳定表达HIF-1α，缺氧可以使HIF-1α蛋白表达增加，与常氧培养组相比有统计学意义。缺氧／复氧后HIF-1α蛋白表达短时间内迅速下降，随即逐渐恢复至常氧表达水平。第二部分材料与方法：体外培养SKOV3细胞，分别缺氧0、8、16、24h。采用RT-PCR检测HIF-1α和E-cad的mRNA表达，western blot检测HIF-1α和E-cad的蛋白表达，RT-PCR和Real time PCR检测SNAIL基因的mRNA表达，了解缺氧对SKOV3细胞E-cad表达的影响。用HIF-1α抑制剂Rapamycin预处理细胞30分钟后，并在缺氧处理后，检测上述各指标的变化，探讨E-cad与HIF-1α表达的关系。结果：常规培养的SKOV3稳定表达HIF-1α和E-cadherin。缺氧使HIF-1α蛋白水平表达增加，于缺氧16h达到峰值，为对照组的6.2倍（P=0.005），并维持高表达：缺氧不同时间，HIF-1a的mRNA表达无明显变化。E-cad的mRNA和蛋白均随缺氧时间延长而表达下降，缺氧16和24h其表达分别为对照组的48％（P=0.002）和5％（P=0.0003）。E-cadherin的直接抑制因子SNAIL基因的mRNA表达则随缺氧时间延长而逐渐增强，real time PCR显示常氧培养的SKOV3中SNAIL表达为1.350±0.107×106，缺氧8h其表达为1.831±0.121×106，缺氧16h为3.978±0.373×106，缺氧24h为5.681±0.65×106，较对照组相比均有统计学差异。Rapamycin可以抑制缺氧诱导的HIF-1α和SNAIL基因的表达增加，同时恢复缺氧情况下E-cadherin的表达。Rapamycin可以从蛋白水平抑制HIF-1α表达，防止E-cad在缺氧环境中的降低。第三部分材料与方法：运用HIF-1α刺激剂cobalt chloride（COCl2）作用于SKOV3细胞，以使HIF-1α过表达，检测HIF-1α过表达时，Rapamycin对SNAIL表达的影响，比较其HIF-1α和SNAIL之间的作用关系。分别针对SKOV3细胞的HIF-1α和SNAIL基因进行RNA干扰。设计针对HIF-1α和SNAIL基因的SiRNA，转染SKOV3细胞，RT-PCR检测干扰后HIF-1α和SNAIL基因mRNA表达，Real time PCR检测SNAIL基因mRNA表达，Western Blot检测HIF-1α的蛋白表达。进一步明确两者之间的相互关系。结果：利用CoCl2作用于SKOV3细胞，使HIF-1α过表达，则Rapamycin失去对SNAIL基因的抑制作用。RNA干扰显示，HIF-1α的SiRNA不但可以下调HIF-1α的表达，还可以抑制SNAIL基因的mRNA表达，而SNAIL的SiRNA对HIF-1α的表达无影响。结论：缺氧／复氧可增强卵巢癌细胞株SKOV3的增殖和侵袭能力，降低肿瘤细胞之间的粘附能力。这些改变部分可能是通过改变细胞周期分布，增加MMP2的分泌，调整HIF-1α、SNAIL和E-cad等信号转导因子的表达来实现的，实现对缺氧／复氧环境变化的适应。常氧培养的卵巢癌细胞株SKOV3不但可以表达HIF-1α的mRNA，还可以稳定表达HIF-1α蛋白。缺氧可以增加SKOV3细胞HIF-1α蛋白和SNAIL基因mRNA的表达，降低E-cad的表达。Rapamycin不但可以抑制HIF-1α蛋白的表达，还可以抑制SNAIL基因mRNA的表达，从而恢复缺氧E-cad的表达。Rapamycin对SNAIL的抑制作用是通过抑制HIF-1α来实现的。HIF-1α可能是SNAIL基因的一个上游调节因子。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 缺氧/复氧后,卵巢癌细胞株SKOV3增值和侵袭能力的改变及其相关机制
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 缺氧对卵巢癌细胞株SKOV3的E-cad表达的影响
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 HIF-1α与SNAIL基因的相互关系
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 研究生期间发表、投稿的文章