乳杆菌DM9811对数生长期培养基滤液RNA组分与HT-29细胞和VSV相互作用研究

论文摘要

目的:乳杆菌在维持宿主肠道自稳,促进肠道免疫系统成熟,提高机体免疫力,保持宿主健康等方面发挥着重要的作用。本课题组发现乳杆菌DM9811对数生长期培养基滤液中存在大量的100bp左右的核酸组分,该核酸组分的性质、来源、核苷酸序列、生物学功能等具有重要的研究价值。本实验通过对乳杆菌DM9811对数生长期培养基滤液中核酸组分的提取和分析,观察其可能的来源;通过其在体外对肠道肿瘤细胞增殖的影响,探讨其对肠道肿瘤细胞的作用及其机制。通过其对VSV感染细胞的影响研究及其诱导细胞产生IFN的研究,探讨其在抵抗肠道病毒性感染性疾病方面的作用及其机制。为阐明乳杆菌DM9811与宿主相互作用规律的分子机制奠定基础。方法:1、乳杆菌DM9811对数生长期培养基滤液中核酸的提取、纯化、保存。绘制乳杆菌DM9811的细菌生长曲线。取对数生长期培养基滤液,核酸提取,并定量分析,观察其与细菌生长曲线的关系;电泳分析滤液中核酸组分的组成,用RNase（Free DNase）处理提取物,同时抽提相同条件下处理的细菌培养基,观察分析核酸组分可能的来源,将提取的核酸组分保存于液氮中。2、观察核酸组分对HT-29细胞增殖的影响及其机制。调整HT-29细胞浓度为1.0×105/mL,MTT法观察不同核酸组分终浓度,作用24h、48h、72h、96h时对HT-29细胞生长的影响,计算细胞生长抑制率。取终浓度为200μg/mL进行24h、48h、72h时细胞周期测定,并检测相应细胞周期相关蛋白mRNA的表达情况。3、观察核酸组分对VSV感染细胞的抑制作用及其机制。用HEp-2细胞扩增VSV,进行TCID50检测。调整WI-38细胞浓度为2.5×105/mL,接种于细胞培养板形成细胞单层,而后进行病毒学实验。检测不同核酸组分终浓度对WI-38细胞的毒性作用,竞争性抑制病毒感染的作用,阻断病毒侵入的作用,抑制病毒生物合成的作用及诱导细胞产生IFN的抗病毒效应,病毒感染情况以细胞存活率检测。免疫荧光检测核酸组分抑制病毒感染细胞的分子机制。结果:1、乳杆菌DM9811细菌在接种后第012h之间为对数生长期,其世代时间为1.95h。琼脂糖电泳分析该核酸组分为RNA,其片段约为100bp左右。发现核酸组分的量与细菌数量呈现明显的正相关。经RNase（Free DNase）处理后未见条带,说明其中无DNA存在,表明对数期基本不存在细菌裂解,此RNA可能是由细菌分泌产生的。核酸组分保存于液氮中1月左右后,结果显示无明显的降解。2、体外对HT-29细胞增殖的影响:核酸组分对HT-29细胞生长具有明显抑制效果,抑制率呈现显著的时间剂量依赖性,终浓度200μg/mL作用96h时抑制率为63.29±3.49%。核酸组分作用于HT-29细胞24h时细胞周期检测结果显示为显著的G1/S期阻滞,并随着作用时间的延长,细胞凋亡率增加显著。RT-PCR检测G1/S期细胞周期相关蛋白,Cyclin D1、Cyclin E的表达明显下降,CDK2、CDK4表达有下降,CDK6表达有上升,p27Kip1、p53的表达明显升高,PCNA的表达明显降低。3、体外对VSV感染细胞的影响:VSV扩增后,其TCID50为10-5.56/0.1mL。核酸组分对WI-38细胞在本实验的浓度范围内无明显细胞毒性作用。核酸组分终浓度为200μg/mL时竞争性抑制病毒感染作用和阻断病毒侵入细胞的作用效果明显,但抑制病毒生物合成的作用不明显。核酸组分无明显诱导WI-38细胞产生抗病毒效应,但可有效诱导BALB/c小鼠脾细胞产生IFN-α的抗病毒效应,并呈现一定的剂量依赖性。细胞免疫荧光检测结果为核酸组分可抑制VSV吸附细胞,从而阻止病毒对细胞的感染。结论:1、乳杆菌DM9811对数生长期培养基滤液中存在着大量的100bp左右的RNA片段,此RNA的来源可能是细菌分泌的。2、核酸组分对HT-29细胞的生长具有显著的抑制作用,抑制作用呈现明显的时间剂量依赖性,细胞周期检测结果显示为明显的G1/S期阻滞。3、核酸组分在实验检测的浓度范围内对WI-38细胞无毒性,其对VSV具有竞争性抑制作用和阻断其侵入细胞作用,可诱导BALB/c小鼠脾细胞产生IFN-α,并呈现出剂量依赖性。核酸组分可抑制VSV吸附到细胞表面,从而阻止病毒对细胞的感染。

论文目录

• 一、正文
• （一） 中文摘要
• （二） 英文摘要
• （三） 前言
• （四） 材料与方法
• （五） 结果
• （六） 讨论
• （七） 结论
• （八） 参考文献
• 二、文献综述
• （一） 综述
• （二） 参考文献
• 三、致谢