定量方法研究原核细胞的DNA损伤修复过程动力学

论文摘要

细胞的DNA经常受到各种物化因素的攻击而产生损伤。损伤导致遗传性状的不稳定,所以细胞进化出了一套完善的机制处理这种紧急情况,包括控制细胞周期,修复损伤,在真核细胞中还包括触发细胞自杀。DNA修复反应还会主动引入突变,以期产生适应新环境的后代。上述这些工作需要相互配合,协同作用,使细胞在损伤后获得最大存活机会。大肠杆菌的SOS反应作为研究DNA损伤修复反应的经典模式系统,已积累了大量观测数据。为了综合利用这些数据,了解DNA损伤修复过程的进化优势,本文借助数学模型对SOS反应过程进行分析。本文建立了描述SOS反应过程的随机模型,解释了单细胞中SOS反应诱导信号呈现的类周期调制现象,是目前唯一完整描述SOS反应过程的随机模型。我们提出,诱导信号受类周期调制的原因是细胞内有限几个复制叉在复制过程中间歇性遇到DNA损伤,以致诱导信号被非连续的触发。经过参数拟合和稳定性分析,我们证实触发的间隔时间与系统动力学性质有关,而不是完全随机的。为了进一步验证我们的理论模型,我们设计了分子生物实验,用免疫印迹法定量测量了导致突变的蛋白UmuD的表达量。我们获得了对UmuD和UmuD’(UmuD的变体)有适合的亲和力比例,能同时定量表征两者in vivo水平的抗体。这样我们可以将免疫印迹实验的精度提高到能估计单细胞含有的蛋白个数。我们发现,随着损伤程度的加重,UmuD/UmuD’表达的动力学明显不同。为了解释这种区别,我们在数学模型中考虑了DNA损伤导致细菌生长变慢的因素,模拟了UmuD/UmuD’细胞内水平的动力学曲线。通过测量与模拟,我们发现SOS突变主要发生在损伤被修复后,这意味着SOS突变的作用主要是适应环境变化,而不是损伤发生后帮助DNA复制的恢复。在应用研究方面,我们利用SOS反应元件构造交替开关式基因回路。在间断的紫外照射下,两种颜色的荧光蛋白将交替表达。基因回路可分为两个模块:一个双稳态和一个或非门。双稳态的输出和紫外触发的SOS反应为或非门的两个输入信号,而或非门的输出控制双稳态的跳转。我们建立了一个微分方程模型,证实了该设计在理论上的可行性。在实验构建方面,我们已成功分别得到了性能良好的或非门和双稳态,可以作为今后进行拼接的候选元件。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 动力学分析方法在生物学中的应用
• 1.1 动力学概念对揭示生命过程规律的作用
• 1.1.1 振荡
• 1.1.2 双稳态
• 1.1.3 鲁棒性
• 1.1.4 随机过程
• 1.2 数学建模方法
• 1.2.1 基因表达与酶催化反应的微分方程模型
• 1.2.2 随机模型
• 1.3 细胞DNA 损伤修复反应中的动力学问题
• 1.3.1 细胞DNA 损伤修复反应中的动力学问题
• 1.3.2 大肠杆菌的SOS 反应
• 1.3.3 SOS 反应动力学过程的定量研究
• 1.3.4 小结：研究SOS 反应动力学的意义及本论文内容
• 第二章 大肠杆菌SOS 反应中类周期调制现象的模拟解释
• 2.1 引言：单细胞的SOS 反应实验现象
• 2.2 大肠杆菌SOS 反应过程的分子机制
• 2.2.1 SOS 的诱导信号：RecA 的激活和LexA 的解体
• 2.2.2 SOS 基因的诱导表达
• 2.2.3 核酸剪切修复（Nucleotide Excision Repair, NER）
• 2.2.4 容错复制（Trans-Lesion Synthesis, TLS）
• 2.2.5 重组修复（Recombinational Repair，RR）
• 2.3 SOS 反应的随机过程模拟
• 2.3.1 DNA 复制，RecA 的激活和LexA 的解体
• 2.3.2 SOS 基因的诱导表达
• 2.3.3 NER，TLS 和RR
• 2.4 模拟结果
• 2.4.1 细胞群体行为的模拟
• 2.4.2 单细胞行为的模拟
• 2.4.3 参数稳定性分析
• 2.5 模型的改进
• 2.5.1 原模型的不足与修正
• 2.5.2 新的模拟结果
• 2.6 小结
• 第三章 大肠杆菌SOS 反应的诱导曲线测量与动力学模拟
• 3.1 引言：UmuD 与UmuD’表达量的动力学曲线
• 3.2 免疫印迹法测量细胞内UmuD 和UmuD’表达量
• 3.2.1 UmuD 和UmuD’的提纯
• 3.2.2 抗体的获得
• 3.2.3 抗体的纯化
• 3.3 大肠杆菌SOS 反应的定量测量
• 3.3.1 细菌接受紫外线照射
• 3.3.2 成活率
• 3.3.3 突变率
• 3.3.4 生长速率
• 3.3.5 UmuD 和UmuD’表达量
• 3.3.6 完整实验过程
• 3.3.7 免疫印迹实验结果的定量分析
• 3.4 实验工作的理论分析
• 3.4.1 模型方程
• 3.4.2 模拟结果与小结
• 第四章 SOS 系统在合成生物学中的应用—交替式开关
• 4.1 引言：对SOS 系统动力学特性的应用
• 4.2 调控网络的设计
• 4.3 过程模拟与描述
• 4.4 实验结果
• 4.4.1 各种SD 信号的测试
• 4.4.2 双稳态的构建与测试
• 4.4.3 或非门的构建与测试
• 4.4.4 同基因型下的表型差异——噪声的体现
• 4.5 小结
• 总结
• 参考文献
• 博士期间发表论文
• 致谢