穿刺巴氏杆菌的分离与鉴定

论文摘要

根结线虫是一类分布广、危害大、难以防治的植物寄生线虫,严重危害我国与世界的农业生产。穿刺巴氏杆菌是根结线虫的专性寄生菌,在根结线虫防治领域有着广阔的应用前景。为了挖掘穿刺巴氏杆菌资源,本研究从海南岛根结线虫发病区广泛采集样品,从中获取穿刺巴氏杆菌菌株并对其进行鉴定。主要研究内容如下：采集海南19种不同植物的病根及相应根际土样共76份,从6份样品中检测到巴斯德氏芽菌属疑似菌株,编号为PPh01-PPh06,这6株菌的寄主线虫涉及南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫和象耳豆根结线虫,寄主植物有胡椒和香蕉,相关土壤类型为沙壤土和壤土。分别采用研磨法、石英砂震荡法、超声波法对菌株孢子破壁,结果显示3种方法均能成功提取巴斯德氏芽菌DNA,以石英砂震荡法效果最佳。结合形态学方法与16S rDNA序列分析对6株菌株进行了鉴定,这些菌株与穿刺巴氏杆菌形态相似。进一步将这6株菌的16S rDNA序列与同源性较高的菌株进行系统进化分析,结果显示,在发育树上,这6株菌形成2个主要类群,其中2株（PPh01、PPh06）形成一个类群,与报道的Pasteuria penetrans处于一个分支,与Pasteuria penetransT的16S rDNA同源性为99%,因而将这2株菌鉴定为穿刺巴氏杆菌（Pasteuria penetrans）;另4株（PPh02-PPh05）单独形成一另类群,与Pasteuria penetransT的16S rDNA同源性为97%,鉴定为巴斯德氏芽菌（Pasteuria sp.）,可能是巴斯德氏芽菌属内一个新的类群。为了对土壤中穿刺巴氏杆菌进行检测,本研究对土壤基因组DNA提取方法进行了改良,并利用巴斯德氏芽菌特异引物对提取的DNA进行了PCR检测,结果显示,氯化钙-核酸提取仪法提取DNA效果最好。应用该方法对土壤中穿刺巴氏杆菌进行检测,土壤中穿刺巴氏杆菌孢子可检测的最低浓度为1000个/g土壤。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 根结线虫的危害及防治
• 1.1.1 根结线虫的危害
• 1.1.2 根结线虫的防治
• 1.2 穿刺巴氏杆菌的生物学特性
• 1.3 穿刺巴氏杆菌的生态学特征
• 1.4 穿刺巴氏杆菌的生防应用
• 1.5 穿刺巴氏杆菌的分类研究
• 1.5.1 巴斯德氏芽菌分类研究的历史沿革
• 1.5.2 形态学
• 1.5.3 免疫学技术的应用
• 1.5.4 分子生物学方法
• 1.5.4.1 16S rRNA基因
• 1.5.4.2 其他基因
• 1.6 本研究的目的意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要仪器
• 2.1.2 主要药品及试剂
• 2.1.3 引物
• 2.1.4 培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 样品采集
• 2.2.2 样品分离与检测
• 2.2.3 孢子破壁方法
• 2.2.3.1 研磨法
• 2.2.3.2 石英砂震荡法
• 2.2.3.3 超声波法
• 2.2.4 菌株的鉴定
• 2.2.4.1 形态鉴定
• 2.2.4.2 基于16S rDNA序列的系统发育分析
• 2.2.5 土壤中微量穿刺巴氏杆菌检测
• 2.2.5.1 土壤基因组DNA提取方法
• 2.2.5.2 DNA检测
• 2.2.5.3 微量穿刺巴氏杆菌的检测
• 3 结果与分析
• 3.1 样品的采集与检测
• 3.2 分离的巴斯德氏芽菌菌株
• 3.3 菌株的鉴定
• 3.3.1 形态鉴定
• 3.3.2 三种孢子破壁方法的比较
• 3.3.3 基于16S rDNA序列的系统发育分析
• 3.4 土壤中微量穿刺巴氏杆菌的检测
• 4 讨论
• 4.1 巴斯德氏芽菌的发生与分布
• 4.2 穿刺巴氏杆菌孢子破壁方法
• 4.3 穿刺巴氏杆菌鉴定
• 4.4 土壤中穿刺巴氏杆菌的检测
• 5 结论
• 项目资助
• 参考文献
• 附录1 6株穿刺巴氏杆菌16S rDNA序列
• 附录2 缩略词表
• 致谢