栉孔扇贝（Chlamys farreri）精巢细胞体外培养的初步研究

论文摘要

贝类细胞培养主要是在研究各种经济贝类病害病理中发展起来的,虽然目前贝类细胞培养可以满足病毒学和一些生理学研究的基本要求,但是仍然不能像其它门类动物一样成功地建立细胞系,这在很大程度上限制了贝类功能基因等的研究。贝类细胞不能成功建系的原因之一是细胞在体外很少增殖,干细胞具有旺盛的增殖能力和分化潜能,因此选择生殖腺中的生殖干细胞进行贝类体外培养,预期可在贝类细胞培养方面建立一些经验。论文以栉孔扇贝精巢组织为培养对象,比较了3种接种方法（常规植块法、倒置植块干贴法、5%FBS孵育植块接种法）对精巢组织的培养效果,得出:5%FBS孵育接种法能增强植块周围细胞的迁出,迁出量最大可达对照组的1.5倍,培养7 d后细胞的存活率为对照组的3倍以上,精巢细胞在体外最长存活16 d左右;以L-15为基本培养基,比较了3种添加物（EGF、牛胰岛素、Vc）对栉孔扇贝精巢组织细胞的培养效果,正交实验结果显示,EGF利于细胞的迁出和贴壁,30 ng/ml EGF组细胞迁出距离最大,为400μm,贴壁率最高达82.5%;同一EGF浓度下,10μg/ml胰岛素可较好的促进细胞迁出、贴壁,并维持细胞的高存活率。在30 ng/ml EGF各组观察到疑似分裂末期的细胞,以及早期生精细胞的增殖现象,但随着培养细胞逐渐分化,细胞最终出现空泡而退化,在30 ng/mlEGF、10μg/ml牛胰岛素、25μg/mlVc条件下少数细胞存活20 d后出现退化。其余各组细胞存活时间维持在16 d左右。本文首次采用差速贴壁分离的方法对栉孔扇贝的生精细胞进行了分离培养,形态学和Cf-vasa原位杂交鉴定,分离培养产物中以生精细胞为主,由此确定这是一种有效地获得大量纯度较高的生精细胞的方法,为下一步筛选更有效的栉孔扇贝精原细胞体外培养体系奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 海洋无脊椎动物细胞培养的研究现状
• 1.1 海洋节肢动物的细胞培养
• 1.2 软体动物的细胞培养
• 1.3 其他海洋无脊椎动物的细胞培养
• 2 精巢组织的细胞培养研究概述
• 2.1 哺乳动物精巢体外培养的研究
• 2.2 鱼类精巢体外培养的研究
• 2.3 无脊椎动物精巢体外培养的研究
• 3 生精细胞体外分离的研究现状
• 4 本论文的研究目的和意义
• 第二章 栉孔扇贝精巢组织体外培养条件优化
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果
• 2.1 接种方法对精巢细胞体外培养的影响
• 2.2 多因子对精巢细胞体外培养的影响
• 3 讨论
• 3.1 精巢组织细胞培养特点
• 3.2 精巢组织细胞培养优化
• 4 小结
• 第三章 栉孔扇贝生精细胞的分离培养及鉴定
• 1 材料方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果
• 2.1 生精细胞的分离
• 2.2 生精细胞的体外培养
• 2.3 分离培养生精细胞的Cf-vasa 原位杂交鉴定
• 3 讨论
• 3.1 生精细胞的分离
• 3.2 生精细胞培养
• 3.3 生精细胞的Cf-vasa 原位杂交鉴定
• 4 小结
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历
• 发表论文