细菌氨肽酶的产酶条件优化及应用研究

论文摘要

蛋白质水解可产生肽类物质和少量氨基酸,明显改善了其溶解性、热稳定性以及营养特性,但其水解液往往会呈现苦味,应用受到了极大的限制。氨肽酶可从氨端切除苦味肽上的疏水氨基酸,从而达到脱苦的目的。本论文主要研究了氨肽酶的产酶发酵条件、酶学性质以及其在大豆分离蛋白中的应用。优化后的最佳发酵条件为:玉米淀粉40 g/L,豆渣30 g/L,K2HPO4 3.216 g/L,KH2PO4 0.074 g/L,MgSO4?7H2O 0.3 g/L,NaCl 1g/L,CoCl2 1mL（0.1mol/L）,培养时间24h,pH值7.5,接种量8%,装液量20mL/250mL,温度40oC,转速200r/min。优化后的发酵液酶活为2685.6U/mL,比原配方发酵液酶活提高了1.71倍,在7L发酵罐上扩大培养,酶活达到1200 U/mL。粗酶液经20%～40%乙醇分级沉淀,回收率为50.3%。研究表明,酶的半衰期为22天,最适反应温度为55℃,最适pH为8.5,温度稳定范围20～70℃,pH稳定范围在8.0～10.0左右。甘油、蛋白胨对酶活的影响不大,但在含有明胶等化合物的溶液中,酶活损失较严重; Zn2+、Ni2+对酶活有较强的抑制作用,Co2+对酶活有较强的激活作用;Pepstatin有轻微抑制,EDTA有强烈抑制作用,而Co2+可解除EDTA的抑制作用;枯草芽孢杆菌Zj016氨肽酶活性中心可能结合了两个Zn2+,每个亚基一个;米氏常数Km为0.53mmol/L,最大反应速度Vmax为19.23μmol/L/min。应用研究表明,氨肽酶与碱性蛋白酶对大豆分离蛋白协同水解的最佳水解条件为:温度50℃、pH8.5、两酶与底物浓度比均为10000U/g、底物浓度60g/L,水解时间4h,水解度达25.0%。对碱性蛋白酶单酶与双酶的水解产物研究结果对比表明:双酶水解产物的苦味明显低于单酶水解产物,几乎不呈现苦味;两种酶解产物的分离峰峰型、分子量分布及比例有较大的差异,两酶协同水解产物的疏水值均低于单酶水解产物的;两酶协同水解产物游离氨基酸含量为1610mg/L,碱性蛋白酶单酶水解产物游离氨基酸含量为1250mg/L。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 立题意义
• 1.2 研究背景
• 1.2.1 氨肽酶的分类
• 1.2.2 氨肽酶的来源
• 1.2.3 氨肽酶的测定方法及纯化方法
• 1.2.4 氨肽酶的应用
• 1.3 国内外研究现状
• 1.3.1 国外研究现状
• 1.3.2 国内研究现状
• 1.4 本论文研究内容
• 第二章 氨肽酶发酵条件优化
• 2.1 前言
• 2.2 材料
• 2.2.1 菌种
• 2.2.2 主要试剂及仪器
• 2.3 试验方法
• 2.3.1 种子培养基
• 2.3.2 发酵基础培养基
• 2.3.3 发酵罐培养基
• 2.3.4 种子一级培养
• 2.3.5 种子二级培养
• 2.3.6 摇瓶培养
• 2.3.7 7L发酵罐培养
• 2.3.8 氨肽酶活性测定
• 2.3.9 菌体干重测定
• 2.3.10 还原糖测定
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 碳源种类对菌株Zj016产酶的影响
• 2.4.2 氮源种类对菌株Zj016产酶的影响
• 2.4.3 碳氮比对菌株Zj016产酶的影响
• 2.4.4 磷源对产酶的影响
• 2.4.5 硫酸镁浓度对产酶的影响
• 2.4.6 培养条件对菌株产酶的影响
• 2.4.7 发酵时间对产酶的影响
• 2.4.8 消泡剂对产酶的影响
• 2.4.9 菌种在优化后的合成培养基中的发酵曲线
• 2.5 小结
• 第三章 氨肽酶酶学性质研究
• 3.1 前言
• 3.2 材料
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 酶活力测定
• 3.3.2 蛋白质浓度的测定
• 3.3.3 氨肽酶粗酶的制备
• 3.3.4 乙醇分级沉淀
• 3.3.5 粗酶半衰期的测定
• 3.3.6 最适温度
• 3.3.7 温度稳定性
• 3.3.8 最适pH
• 3.3.9 pH稳定性
• 3.3.10 化学物质的影响
• 3.3.11 金属离子的影响
• 3.3.12 不同抑制剂的影响
• 3.3.13 氨肽酶活性中心金属离子的鉴定
• 3.3.14 米氏常数Km及最大反应速度Vmax的测定
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 醇沉曲线
• 3.4.2 氨肽酶的半衰期
• 3.4.3 氨肽酶的最适反应温度
• 3.4.4 氨肽酶的温度稳定性
• 3.4.5 氨肽酶的最适pH
• 3.4.6 氨肽酶的pH稳定性
• 3.4.7 化学物质的影响
• 3.4.8 金属离子对氨肽酶的影响
• 3.4.9 不同抑制剂对氨肽酶的影响
• 3.4.10 氨肽酶活性中心金属离子的初步鉴定
• 3.4.11 米氏常数Km及最大反应速度Vmax的测定
• 3.5 本章小结
• 第四章 氨肽酶在大豆分离蛋白水解中的应用研究
• 4.1 前言
• 4.2 材料
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 蛋白质含量的测定
• 4.3.2 DH值（水解度）测定
• 4.3.3 氨基氮的测定
• 4.3.4 大豆分离蛋白水解液分子量分布的测定
• 4.3.5 疏水值S0的测定
• 4.3.6 碱性蛋白酶酶活力测定
• 4.3.7 苦味评价方法
• 4.3.8 大豆分离蛋白的酶解反应
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白水解条件的研究
• 4.4.2 氨肽酶水解大豆分离蛋白水解条件的研究
• 4.4.3 双酶水解条件的研究
• 4.4.4 最佳水解条件下双酶协同水解与碱性蛋白酶单酶水解结果比较
• 4.5 小结
• 第五章 结论与展望
• 5.1 主要结论
• 5.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的论文