鬼臼毒素衍生物抑制秀丽隐杆线虫Ras/MAPK信号通路的过度激活及毒性研究

论文摘要

鬼臼毒素及其衍生物的抗肿瘤活性被广泛应用于多种肿瘤的治疗,如淋巴瘤、小细胞肺癌、非何杰氏病、非白血性白血病、乳腺癌、膀胱癌和睾丸癌等。它们的抗肿瘤机制主要包括抑制细胞有丝分裂过程中微管蛋白聚合和通过形成DNA-拓扑异构酶Ⅱ-药物分子的稳定复合物导致DNA异常重组。但是,关于鬼臼毒素衍生物是否可以下调过度激活的Ras信号途径尚属空白。因此,本实验利用秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）ras（gf）突变会导致多产卵器（multivulva,Muv）的表型这一特点对鬼臼毒素衍生物下调Ras/MAPK信号通路过度激活的作用进行研究。此外,由于鬼臼毒素在临床上应用时毒性较大,而秀丽隐杆线虫已被广泛用作毒性研究的有力工具。因此,本论文另一个内容是利用秀丽隐杆线虫对鬼臼毒素衍生物的毒性进行评价。本文利用秀丽隐杆线虫作为模式生物,对10种新合成的鬼臼毒素衍生物下调Ras/MAPK信号通路过度激活的作用和毒性做了系统的研究。结果表明,p-18（药物编号）、p-19和p-213种鬼臼毒素衍生物能够下调Ras/MAPK信号通路过度激活,但也存在较大的毒性。200μM的p-18、400μM的p-19和200μM的p-21对秀丽隐杆线虫MT2124突变体线虫的假阴门表型有明显的抑制作用,其野生型比例分别高于溶媒组7%、6%和7%。3种鬼臼毒素衍生物对秀丽隐杆线虫的体长、体宽和阴门位置的毒性研究显示：p-18和p-21在有效的浓度下对体长、体宽和阴门位置都没有影响。p-19仅对线虫体长有明显的毒性作用,使体长增长并呈现明显的剂量关系。3种鬼臼毒素衍生物抑制拓扑异构酶Ⅱ活性研究表明,3种衍生物均能抑制DNA拓扑异构酶Ⅱ的活性,p-18、p-19和p-21的酶抑制半数作用剂量（ICso）分别为：39.57±1.597μM、16.596±1.220μM和376.99±2.576μM。综合体内、体外实验结果以及药效与毒性的关系,p-18的药效高并且毒性小适宜作为候选药物进一步研究。p-21的浓度超过200μM时,可能药效会更好,还需要用其它模型对其进行评价。

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• Abstract
• 第一部分 文献综述
• 1.1 鬼臼毒素及其衍生物
• 1.1.1 鬼臼毒素及其衍生物的抗肿瘤作用机制
• 1.1.1.1 抑制微管蛋白聚合
• 1.1.1.2 抑制DNA拓扑异构酶Ⅱ活性
• 1.1.1.3 其他机制
• 1.1.2 鬼臼毒素及其衍生物的结构与药效的关系
• 1.1.2.1 抑制微管蛋白聚合作用的构效关系
• 1.1.2.2 抑制DNA拓扑异构酶Ⅱ活性的构效关系
• 1.2 秀丽隐杆线虫在筛选下调Ras/MAPK信号通路药物中的应用研究
• 1.2.1 ras基因和Ras蛋白
• 1.2.2 Ras/MAPK信号途径
• 1.2.3 基于Ras/MAPK信号通路的靶点药物
• 1.2.3.1 Ras靶点抑制剂
• 1.2.3.2 Raf靶点抑制剂
• 1.2.3.3 MEK靶点抑制剂
• 1.3 秀丽隐杆线虫在毒性方面的研究进展
• 1.4 课题的提出
• 第二部分 依托泊苷注射液下调Ras/MAPK信号通路过度激活的作用
• 2.1 引言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.1.1 实验动物
• 2.2.1.2 实验菌株
• 2.2.1.3 实验药品
• 2.2.1.4 实验试剂
• 2.2.1.5 主要仪器
• 2.2.1.6 培养基
• 2.2.1.7 缓冲液
• 2.2.1.8 药物的稀释
• 2.2.2 方法
• 2.2.2.1 线虫的传代与培养
• 2.2.2.2 线虫的表型纯化
• 2.2.2.3 线虫的同步化
• 2.2.2.4 液体板的制备
• 2.2.2.5 突变体线虫株系中野生型线虫的比例计数
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 依托泊苷注射液对MT2124的作用
• 2.4 讨论
• 第三部分 鬼臼毒素衍生物下调Ras/MAPK信号通路过度激活的作用
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 仪器
• 3.2.3 培养基
• 3.2.4 缓冲液
• 3.2.5 药物的稀释
• 3.2.6 方法
• 3.2.6.1 溶媒的配制
• 3.2.6.2 转板
• 3.2.6.3 线虫的处理方法和药板的制备
• 3.2.6.4 突变体线虫株系中野生型线虫的比例计数
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 依托泊苷粉末的溶解情况
• 3.3.2 鬼臼毒素衍生物p-12对MT2124的作用
• 3.3.3 鬼臼毒素衍生物p-13对MT2124的作用
• 3.3.4 鬼臼毒素衍生物p-14对MT2124的作用
• 3.3.5 鬼臼毒素衍生物p-15对MT2124的作用
• 3.3.6 鬼臼毒素衍生物p-16对MT2124的作用
• 3.3.7 鬼臼毒素衍生物p-17对MT2124的作用
• 3.3.8 鬼臼毒素衍生物p-18对MT2124的作用
• 3.3.9 鬼臼毒素衍生物p-19对MT2124的作用
• 3.3.10 鬼臼毒素衍生物p-20对MT2124的作用
• 3.3.11 鬼臼毒素衍生物p-21对MT2124的作用
• 3.3.12 鬼臼毒素衍生物p-18、p-19和p-21下调Ras/MAPK信号通路作用效果比较
• 3.4 讨论
• 第四部分 鬼臼毒素衍生物的毒性研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 材料
• 4.2.2 仪器
• 4.2.3 培养基
• 4.2.4 缓冲液
• 4.2.5 药物的稀释
• 4.2.6 方法
• 4.2.6.1 转板
• 4.2.6.2 线虫的处理方法和药板的制备
• 4.2.6.3 线虫的体长和体宽的测量方法
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 鬼臼毒素衍生物p-18对线虫体长、体宽和阴门位置的影响
• 4.3.1.1 鬼臼毒素衍生物p-18对线虫体长的影响
• 4.3.1.2 鬼臼毒素衍生物p-18对线虫体宽的影响
• 4.3.1.3 鬼臼毒素衍生物p-18对线虫阴门位置的影响
• 4.3.2 鬼臼毒素衍生物p-19对线虫体长、体宽和阴门位置的影响
• 4.3.2.1 鬼臼毒素衍生物p-19对线虫体长的影响
• 4.3.2.2 鬼臼毒素衍生物p-19对线虫体宽的影响
• 4.3.2.3 鬼臼毒素衍生物p-19对线虫阴门位置的影响
• 4.3.3 鬼臼毒素衍生物p-21对线虫体长、体宽和阴门位置的影响
• 4.3.3.1 鬼臼毒素衍生物p-21对线虫体长的影响
• 4.3.3.2 鬼臼毒素衍生物p-21对线虫体宽的影响
• 4.3.3.3 鬼臼毒素衍生物p-21对线虫阴门位置的影响
• 4.4 讨论
• 第五部分 鬼臼毒素衍生物抑制DNA拓扑异构酶Ⅱ活性研究
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 材料
• 5.2.2 仪器
• 5.2.3 试剂的配制
• 5.2.4 培养基
• 5.2.5 方法
• 5.2.5.1 质粒的稀释
• 5.2.5.2 质粒的转化
• 5.2.5.3 菌种的培养与保存
• 5.2.5.4 菌种的扩大培养
• 5.2.5.5 质粒的提取
• 5.2.5.6 酶反应
• 5.2.5.7 电泳
• 5.2.6 结果与分析
• 5.2.6.1 鬼臼毒素衍生物p-18和p-21对DNA拓扑异构酶Ⅱ的活性抑制作用
• 5.2.6.2 鬼臼毒素衍生物p-19对DNA拓扑异构酶Ⅱ的活性抑制作用
• 5.3 讨论
• 第六部分 结论
• 附录
• 参考文献
• 致谢