论文摘要
目的：针对4种已知的人类肿瘤相关microRNA，设计相应的反义寡核苷酸，以LipofectamineTM 2000为载体介导，观察这些microRNA反义寡核苷酸（Antisense-microRNAs-oligonucleotides，AMO）对人肺癌细胞A549与白血病细胞K562的生长和凋亡等生物学活性的影响，筛选出其具有抗白血病和抗肺癌功能的microRNA反义寡核苷酸序列，并对其作用机制进行探讨。方法：1台盼蓝拒染法筛选AMO对肺癌细胞A549和白血病细胞K562的最佳作用浓度：（1） LipofectamineTM2000-AMO复合物的配制：LipofectamineTM2000和AMO按质量比为2.5：1配制。（2）终浓度为0.05μmol／L、0.1μmol／L、0.2μmol／L、0.3μmol／L、0.6μmol／LLipofectamineTM 2000-AMO转染肺癌细胞A549，检测其对A549细胞的生长抑制作用。（3）终浓度为0.1μmol／L、0.2μmol／L、0.3μmol／L、0.6μmol／L LipofectamineTM2000-AMO转染白血病细胞K562，检测其对K562细胞的生长抑制作用。2台盼蓝拒染法检测AMO对肺癌细胞A549和白血病细胞K562不同作用时间的生长抑制作用：（1）终浓度为0.3μmol／LAMO转染肺癌细胞A549，观察经过24h、48h、72h作用后，其对A549细胞生长的抑制效果；（2）终浓度为0.6μmol／LAMO转染白血病细胞K562，观察经过24h、48h、72h作用后，其对K562细胞的生长抑制效果；3流式细胞仪检测AMO作用后A549细胞及K562细胞周期以及亚二倍体百分率变化情况：AMO转染肺癌细胞A549和白血病细胞K562，以PI单染流式细胞仪检测经过不同AMO作用时间后，两种肿瘤细胞的细胞周期及亚二倍体峰百分率的变化情况。4实时定量PCR检测经AMO作用不同时间后，人肺癌细胞A549和白血病细胞K562中microRNA的水平变化：AMO转染肺癌细胞A549和白血病细胞K562，以实时定量PCR检测经过不同AMO作用时间后，两种肿瘤细胞miR-21及miR-181a的水平。结果：1 AMO对肺癌细胞A549和白血病细胞K562的最佳作用浓度：（1） AMO作用于肺癌细胞A549，浓度为0.1μmol／L时开始显示抑制作用，其最佳作用浓度为0.3μmol／L。（2） AMO-miR-21和AMO-miR-181a作用于白血病细胞K562，浓度为0.2μmol／L时开始出现抑制作用，0.3μmol／L、0.6μmol／L时抑制效果显著，其最佳作用浓度为0.6μmol／L。2 AMO对肺癌细胞A549和白血病细胞K562生长的抑制作用：（1）终浓度为0.6μmol／L的AMO作用于白血病细胞K562 72h后，与随机对照组相比较，AMO-miR-21和AMO-miR-181a对细胞生长具有显著的抑制作用，且随着作用时间的增加，其抑制效果逐渐增强。（2） AMO与肺癌细胞A549经不同的作用时间后，终浓度为0.3μmol／L时，AMO-miR-16和AMO-miR-181a在48h开始显示对细胞生长的抑制作用，且随着作用时间增加其抑制效果逐渐增强，至72h抑制效果十分明显。同时，AMO-miR-21亦显示出很强的抑制作用。（3） AMO的不同作用时间对白血病细胞K562的生长抑制效果为：终浓度为0.6μmol／L的AMO作用于白血病细胞K562时，AMO-miR-21和AMO-miR-181a在48h开始出现对细胞的生长抑制作用，且随着作用时间其抑制效果逐渐增强。在72h的作用效果非常明显，在96h的抑制作用进一步加强。3 AMO-miR-21和AMO-miR-181a增加肺癌细胞A549和白血病细胞K562的亚二倍体百分率，促进肺癌细胞和白血病细胞的凋亡。（1）经AMO转染肺癌细胞A549 24h、48h、72h后（AMO终浓度为0.3μmol／L），与随机对照组相比，AMO-miR-16组、AMO-miR-21组和AMO-miR-181a组均出现明显的凋亡峰，显示三种AMO都有促进肺癌细胞A549凋亡的作用。经组间比较分析发现，AMO-miR-21组、AMO-miR-181a组促凋亡作用效果最好，有显著的统计学差异（P＜0.05）。（2）经AMO转染白血病细胞K562 24h、48h、72h后（AMO终浓度为0.6μmol／L），与随机对照组相比，AMO-miR-21组、AMO-miR-181a组亚二倍体凋亡峰十分明显，说明两种AMO均能有效地促进白血病细胞K562的凋亡，有显著的统计学差异（P＜0.05）。4经AMO-miR-21和AMO-miR-181a作用不同时间后，人肺癌细胞A549中miR-181a和白血病细胞K562中miR-21和miR-181a的水平显著下降。以终浓度为0.3μmol／L的AMO与人肺癌细胞A549保温48h，终浓度为0.6μmol／L的AMO与白血病细胞K562保温48h、72h，提取总RNA，实时定量PCR检测miR-21和miR-181a在不同组细胞中的含量。结果显示，miR-21的标准曲线中，CT值分别为8.30、13.00、17.07、20.98、25.36、28.57，相关系数为0.998，相关性好，以此作为标准曲线计算microRNA水平。经统计学分析，与随机对照组相比较，AMO与人肺癌细胞A549作用48h后，miR-21在A549细胞中的水平变化不明显，差异没有统计学意义（P＞0.05）。AMO与白血病细胞K562作用48h和72h后，miR-21在K562细胞中的水平下降，具有显著的统计学差异（P＜0.05）。结论：1针对microRNA的AMO能够有效抑制肺癌细胞A549和白血病细胞K562的生长。其中AMO-miR-21、AMO-miR-181a对白血病细胞K562有显著的抑制作用；AMO-miR-16、AMO-miR-21、AMO-miR-181a对肺癌细胞A549抑制效果很好，且都呈现出时效关系与量效关系。2针对microRNA的AMO能够有效促进肿瘤细胞的凋亡，是AMO抑制肿瘤细胞生长的机制之一。AMO-miR-21，AMO-miR-181a促进白血病细胞K562的凋亡；AMO-miR-16、AMO-miR-21、AMO-miR-181a促进肺癌细胞A549的凋亡。3实时定量PCR反映：AMO能够抑制肿瘤细胞中microRNA的水平。AMO-miR-21能够降低miR-21在白血病细胞K562中的水平。4随机对照组与脂质体对照组对细胞生长有一定的非特异性抑制作用。