腹毛类纤毛虫阔口游仆虫微管类细胞骨架及γ-微管蛋白的研究

论文摘要

原生动物纤毛虫具有复杂的微管类细胞骨架,即纤毛器微管骨架和非纤毛器微管骨架系统。其中纤毛器微管骨架包括口纤毛器、体纤毛器微管及其附属微管结构；非纤毛器微管骨架则是由一些与纤毛器无直接联系的微管组成,包括膜微管骨架、表膜下微管层、胞质深部微管,以及与其他细胞器相联系的微管等结构。值得注意的是,具有不同纤毛模式的各类群纤毛虫中,微管类细胞骨架发生不同程度的分化,研究其细胞纤毛器微管及以微管为基本单元的微管胞器的建构和遗传,对于深入揭示真核细胞结构的形成及其细胞调控机理具有重要学术意义。从20世纪80年代开始,以纤毛虫的纤毛器微管为对象,对细胞纤毛模式的形成和调控的研究成为热点,近15年来,对纤毛器微管的研究深入到微管单元和微管蛋白水平,并将研究重点聚焦在纤毛虫细胞周期中纤毛器微管单元是如何发生的,微管又是如何组装为纤毛单元和皮层纤毛器的,以及纤毛器微管发生和装配过程中的调控等方面。自从在膜口类纤毛虫草履虫、四膜虫中发现γ-微管蛋白作为纤毛基体微管组织中心的重要成分,具有参与细胞周期中微管蛋白异二聚体装配的调节,以及维持微管组织中心的稳定性等作用以来,对细胞微管胞器的功能蛋白进行定位,探讨其微管组装和调控的机理成为纤毛虫微管类细胞骨架研究的重要内容。但目前的相关研究仅限于体纤毛分散排布的纤毛虫,对口纤毛器和体纤毛器进一步特化为复合纤毛器的腹毛类纤毛虫,其纤毛器微管的装配及其微管装配过程中的相互作用关系尚不清楚。本文以腹毛类纤毛虫阔口游仆虫（Euplotes eurystomus）为材料,在细胞水平上,应用荧光标记、超微结构方法等从显微、亚显微水平对细胞的纤毛器微管、纤毛器附属微管以及非纤毛器微管等微管类细胞骨架的构建特征和形态发生进行了研究,以期为探索此类纤毛虫微管类胞器的建构、细胞形态发生过程中微管的分化及细胞调控机理取得进一步资料；在蛋白水平上,应用喂食法干扰细胞γ-微管蛋白基因表达,并对该蛋白表达降低所导致的纤毛器微管和非纤毛器微管骨架的变化进行了探讨,为进一步揭示该蛋白在微管组装中的作用机理提供分子细胞及其形态学方面的证据。所得结果如下：应用直接荧光标记和免疫荧光标记显示,阔口游仆虫的皮层细胞微管胞器由纤毛器、纤毛器附属微管和非纤毛器微管组成。细胞腹皮层中,口纤毛器及纤毛器附属微管包括口围带、小膜托架及其内侧口皮层的短微管束,波动膜及其基部紧密排列的月牙状微管网；体纤毛器及纤毛器附属微管由额腹横棘毛、左缘棘毛、尾棘毛以及纤毛器基部前纵微管束、后纵微管束、横微管束和周围微管束构成,其中横棘毛的前纵微管束十分发达,由每个横棘毛基部分别向皮层前端发出,一直延伸到第一根额棘毛右侧,并在此汇聚。背皮层含背触毛及其基部附属微管,后者由云雾状物质形成致密的花瓣状结构围绕背触毛基体一周。背、腹皮层非纤毛器微管骨架包括覆盖于整个皮层表面的细小网格状微管,存在于背皮层中的斜向微管骨架及贯穿于细胞纵长的表膜下纵微管层,以及于背触毛列之间分布的微管网。结果表明,游仆虫细胞具有巨大型口围带、混合型额腹棘毛、发达的横棘毛前纵微管束以及简化的缘棘毛组合而成的纤毛器及其基部附属微管；此外,细胞自皮层表面至胞质深部形成微管网、微管层和微管束等非纤毛器微管。本文较完整地显示了该种纤毛虫的两类微管胞器系统,在细胞及胞器水平为深入认识腹毛类纤毛虫细胞骨架结构的多样性及其细胞结构的复杂性提供了进一步的资料。2皮层微管类细胞骨架的超微结构超微结构观察显示,阔口游仆虫纤毛器微管中,纤毛基体由微管三联体构成,基体之间以前后及斜向连接纤维连成整体并以围棘纤维篮包围,基体下方为致密物质形成的托架。棘毛基部微管中,除基体向周围发出的单根微管延伸到胞质深处外,由纤毛器基部向胞质右后方或左前方各发出一束微管分别成为后纵微管束和前纵微管束；基体紧下方的纤毛器基部附属微管束含数十根微管,成葡萄串状。背触毛着生于背脊间的细胞质凹陷处,背触毛基部附属微管以树根状向周围胞质延伸。非纤毛器微管含有由单根或多根微管聚合而成的复合微管胞器,以微管列、微管束和微管网等形式定位于皮层特定位置：腹表膜下微管层由单根微管以一定间隔排列而成；背表膜下微管层由倒“品”字型微管单元排列而成,每个微管单元具有3根微管；靠近表膜的颗粒层中存在与表膜成一定角度排列的微管和平行于表膜分布的微管,两者交错形成微管网；胞质中的微管常以数十根到数百根聚集形成微管束,定位于表膜下方,与表膜大致平行并贯穿于胞质,或与表膜呈一定角度斜向排列,微管束及其与表膜之间均存在微管连接；在横棘毛之间的脊状凸起以及背脊表膜加厚层中内也存在大量横向排列的微管。结果表明,细胞皮层纤毛器中除纤毛杆、纤毛基体微管外,其基体间连接纤维、基体托架、基体附属微管、纤毛器基部附属微管束,以及围棘纤维篮等也是皮层纤毛器微管的重要组成部分,各种微管相互联系、聚集形成纤毛器微管骨架系统；细胞非纤毛区皮层含有表膜下微管层、表膜下颗粒层微管、胞质微管束,以及皮层凸起或加厚层的微管,它们由单根微管或多根微管聚合形成阔口游仆虫复杂的非纤毛区皮层微管骨架系统。本文在细胞微管水平较全面地显示了此类游仆虫两类微管类细胞骨架系统,为深入阐述腹毛类纤毛虫中由微管基本单元装配形成的纤毛器和非纤毛器微管类细胞骨架的建构特征提供了基础资料。3皮层纤毛器及其附属微管的形态发生阔口游仆虫形态发生中,在老的口围带基部左侧发生后仔虫口围带原基和波动膜原基,其原基区进一步发展和分化,形成后仔虫的口围带和波动膜；在老的口围带和波动膜位置,于相应结构未见明显变化的情况下形成前仔虫的口围带和波动膜。额腹横棘毛原基区出现在额腹横棘毛区皮层,并经历分段、长纤毛、向前向后迁移等过程最终分化为前、后仔虫的额腹横棘毛。在额腹横棘毛形成和分化的过程中,其基部逐渐长出微管芽并向前向后生长。其中,横棘毛原基的前纵微管芽最先发生,随后是额腹棘毛原基的后纵微管芽,前者随着横棘毛原基向细胞后端迁移而向胞质前端延伸,最终在胞质前端汇聚,形成前后仔虫的前纵微管束,而后者的迁移和延伸方向正好相反。值得注意的是,在额腹横棘毛附属微管形成过程中,老的附属微管结构依然存在,直至前后仔虫分裂。本文较详细地显示了游仆虫形态发生期间纤毛器微管中原基形成、分化和定位的形态,其中也观察到其纤毛器附属微管的发生、生长和迁移定位的过程,这些对其他纤毛虫尚未见报道,所得结果为进一步了解纤毛器附属微管的形态发生提供了新的资料。4γ-微管蛋白的定位和功能分析在阔口游仆虫非分裂期细胞中,γ-微管蛋白主要定位于口围带小膜托架和额腹横棘毛基体、背触毛基体等纤毛器的基体位置,此外,在横棘毛之间排列的棒状微管束、伸缩泡的开口处也观察到荧光标记；在细胞形态发生时期,该蛋白除了定位于所述纤毛器的基体部位外,在细胞腹皮层额腹棘毛与横棘毛之间的额腹横棘毛原基中也显示该蛋白抗体的标记。将阔口游仆虫γ-微管蛋白基因插入到L4440载体两个T7启动子之间,再将该重组质粒转入缺失RNaseⅢ基因的突变型大肠杆菌（Esherichia coli）HT115细胞中,应用IPTG诱导表达大量目的基因dsRNA片段的大肠杆菌喂食游仆虫,干扰其细胞γ-微管基因的表达,结果使游仆虫皮层纤毛器的基体三联体微管中C-微管缺失、部分基体B-微管解体,细胞背皮层表膜下微管层中原按相同间隔规则排列的部分倒“品”字型微管单元的1根微管消失或3根微管全部消失,腹皮层表膜下单根微管按相同间隔排列形成的微管层也有微管缺失或微管排列不规则的现象。并且,其细胞γ-微管蛋白基因的干扰不但影响了相关蛋白的表达,也导致了细胞形态结构的变化,并最终将致使细胞分裂被阻断,细胞最终死亡。由此认为,γ-微管蛋白不仅对维持基体三联体微管的稳定性是重要的,并且对皮层微管结构的完整性及微管排列的稳定性是十分重要的。

论文目录

• 论文摘要
• Abstract
• 第一部分 阔口游仆虫微管类细胞骨架的研究
• 第一章 综述
• 摘要
• 1.1 原生动物皮层细胞骨架研究进展
• 1.2 荧光标记技术在原生动物学研究中的应用
• 参考文献
• 第二章 微管类细胞骨架及其形态发生的直接荧光标记
• 摘要
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 参考文献
• 图版说明
• 图版
• 第三章 细胞纤毛器及其附属微管的免疫荧光标记
• 摘要
• 3.1 材料与方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 参考文献
• 图版说明
• 图版
• 第四章 微管类细胞骨架的超微结构观察
• 摘要
• 4.1 材料与方法
• 4.2 结果
• 4.3 讨论
• 参考文献
• 图版说明
• 图版
• 第二部分 阔口游仆虫γ-微管蛋白及其作用机理的研究
• 第一章 综述
• 摘要
• 1.1 微管蛋白超家族成员和中心蛋白的研究综述
• 1.2 原生动物纤毛基体的研究进展
• 1.3 微管形成于组装的研究进展
• 1.4 RNAi技术研究进展
• 参考文献
• 第二章 阔口游仆虫γ-微管蛋白基因的扩增及测序
• 摘要
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 参考文献
• 图版说明
• 图版
• 第三章 喂食法干扰γ-微管蛋白mRNA表达及细胞形态学检测
• 摘要
• 3.1 材料与方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 参考文献
• 图版说明
• 图版
• 研究生学习期间参与的课题与发表论文
• 致谢