1型鸭疫里默氏杆菌OmpA蛋白间接ELISA方法的建立及应用

论文摘要

鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer）是里默氏杆菌属的代表种,原名鸭疫巴氏杆菌,又称鸭败血症、传染性浆膜炎、鸭疫败血症、新鸭病,鹅的该菌感染被称为鹅流感或渗出性败血症。该病是家鸭、鹅、火鸡和多种鸟类的一种常见的、接触性传染性疾病,呈急、慢性败血症,其基本特征是纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脓性肺炎、干酪型输卵管炎、和细菌性非化脓性脑膜炎等。自Riemer1904年最早在鹅群中分离此菌后,到目前为止,该病呈世界范围分布。在我国,郭玉璞等白1982年在北京首次分离出鸭疫里默氏杆菌以来,在全国许多省市相继均有此病发生的报道,给养鸭业造成了巨大的经济损失。鸭疫里默氏杆菌病的早期诊断是控制该病发生和蔓延的有效手段,因此该病的诊断成为了国内外兽医研究的焦点。世界动物卫生组织公布的陆生动物诊断试验和疫苗手册2004年第五版在马立克病毒检验中提到SPF鸭应排除的疾病的种类包括鸭疫里默氏杆菌病。鸭疫里默氏杆菌的外膜蛋白A是一种能够引起机体免疫反应的重要的蛋白。在病原菌侵入机体时,这类蛋白是重要的毒力因子和免疫原。ompA基因存在于所有的RA血清型参考株中,该基因具有较高的保守性,较小的变异并不能导致其表型的改变。OmpA蛋白是一种较强的抗原决定簇,并不存在RA血清型的差异。本试验扩增了1型鸭疫里默氏杆菌黑龙江地方分离株HLG1 ompA基因的核酸序列,利用DNA Star软件与GenBank公布的24个RA ompA基因序列对比,同源性为94.3%-100%,氨基酸序列同源性为94.3%-100%。本研究构建了重组表达质粒pHtb-ompA,测序表明目的基因序列正确。将该质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）进行表达,经SDS-PAGE凝胶电泳分析,在1mM IPTG诱导条件下,目的蛋白获得表达,重组蛋白大小约为55KDa。通过DNAStrar软件及Western Blot分析目的蛋白的抗原性,均表现出与RA阳性血清具有良好的抗原性。利用Ni＋柱在变性条件下对其进行纯化,获得了较高纯度的OmpA重组蛋白。本试验以纯化的OmpA蛋白为包被抗原进行间接ELISA条件的优化,确定最佳的抗原包被浓度为2.09μg/mL、血清稀释度为1：100、二抗稀释度为1：5000、封闭液为5%的脱脂乳。根据133份阴性血清的检测结果,确定了判断标准：当样品OD450值≥0.304时,判断为阳性,当样品OD450值<0.260时,判断为阴性,OD450值在二者之间为可疑需要复检,如仍小于0.304则判定为阴性；重组蛋白抗原不与大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、网状内皮增生病毒、鸭肠炎病毒、鸭肝炎病毒,以及H5N1流感病毒等阳性鸭血清无交义反应,但能对RA阳性血清有效阻断,表明其具有良好的特异性；重组抗原能与1：25600倍稀释的阳性血清反应表明其具有良好的敏感性；与菌体破碎上清蛋白为抗原的间接ELISA方法进行比对,两者的符合率为91.3%。批内、批间重复试验的变异系数均小于15%,表明其具有良好的重复性。应用该诊断方法检测黑龙江地区鸭血清样品,阴性率为80.2%；SPF鸭血清进行鸭疫里默氏杆菌抗体检测,结果显示2周龄SPF鸭血清抗体均为阴性。本研究成功表达了鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白A,应用DNAStar软件及Western Blot方法对该蛋白进行了抗原性分析,并以此建立了特异、敏感、重复性好的间接ELISA方法。为RA流行病学调查和SPF鸭的净化检测提供了一种简单、快速血清学诊断方法。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 鸭疫里默氏杆菌病病原学概况
• 1.2 鸭疫里默氏杆菌流行病学
• 1.3 临床症状及病理变化
• 1.4 外膜蛋白研究进展
• 1.5 鸭疫里默氏杆菌致病因子与毒力基因
• 1.6 鸭疫里默氏杆菌诊断技术
• 1.7 鸭疫里默氏杆菌的防治
• 1.8 研究的目的和意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 第三章 结果
• 3.1 血清制备
• 3.2 目的基因PCR扩增结果
• 3.3 基因的克隆及序列分析
• 3.4 重组抗原的制备
• 3.5 间接ELISA方法反应条件优化
• 3.6 特异性试验结果
• 3.7 重复性试验结果
• 3.8 保存期试验
• 3.9 敏感性试验结果
• 3.10 符合性试验结果
• 3.11 临床应用结果
• 第四章 讨论
• 4.1 目的基因的选择
• 4.2 重组OMPA蛋白的制备
• 4.3 重组OMPA蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立及分析
• 第五章 总结
• 致谢
• 作者简历
• 附录
• 参考文献