禽网状内皮组织增生症病毒感染对肉鸡主要免疫器官白细胞介素18产生的影响

论文摘要

白细胞介素18（interleukin-18, IL-18）,又称为γ-干扰素（interferon-γ, IFN-γ）诱生因子（interferon-gamma-inducing factor, IGIF）,是一种具有多向和多层次免疫调节功能的细胞因子,与肿瘤、变态反应性疾病、自身免疫性疾病、移植物抗宿主病等的发生发展密切相关,因此它在许多疾病的基础性研究和临床应用中有重要价值。目前,免疫抑制病给我国集约化养鸡业带来了很大危害,禽网状内皮组织增生症病毒（reticuloendotheliosis virus, REV）感染后可导致体液和细胞介导免疫应答的严重抑制已有很多报道,了解免疫抑制机理并制定提高鸡的免疫应答策略正成为当前的研究热点。本研究以禽网状内皮组织增生症病毒造成的免疫抑制为模型,对鸡白细胞介素18在免疫抑制中可能发挥的作用进行了初步探讨。研究内容主要分为两部分:1.成功建立了一种能够检测鸡白细胞介素18的SYBR GreenΙ荧光定量RT-PCR方法。根据GenBank上鸡白细胞介素18基因的序列,在保守区设计并合成各自特异引物,并以核糖体蛋白亚基4基因为内参,采用SYBR GreenⅠ染料以建立实时荧光定量RT-PCR检测方法。将白细胞介素18与核糖体蛋白亚基4基因克隆至pMD18-T载体上,以各阳性质粒作为标准品,构建标准曲线,并进行了熔解曲线分析。结果表明,该方法对鸡白细胞介素18 mRNA的扩增效率为107.16%,线性范围为10-210-6,相关系数为0.998,最低能检出100拷贝/μL;熔解曲线分析荧光定量RT-PCR产物在（80.4±0.6）℃出现单特异峰;从RNA提取到荧光定量PCR结束的检测周期只需4 h。本研究所建立的鸡白细胞介素18基因实时荧光定量RT-PCR方法灵敏度高、特异性强、检测周期短,为在转录水平对鸡IL-18的定量分析奠定了基础。2.实时荧光定量RT-PCR检测禽网状内皮组织增生症病毒感染肉鸡免疫器官白细胞介素18基因表达量的研究。为了研究鸡白细胞介素18基因在禽网状内皮组织增生症病毒感染肉鸡体内的表达水平,120只1日龄肉鸡随机分为2组,禽网状内皮组织增生症病毒处理组和生理盐水对照组。每个处理组分别在感染后7、14、21、28、35和42 d随机取6只鸡处死,迅速取脾脏、胸腺和法氏囊样品用于RNA提取。采用SYBR GreenⅠ染料实时荧光定量RT-PCR,比较处理组和对照组IL-18基因mRNA相对表达量的变化。结果显示,与对照组相比,处理组脾脏、胸腺和法氏囊中IL-18的分泌水平在感染后7d和14d均显著（P<0.05）升高,在21d、28d、35d和42d表达差异（P<0.05）也均显著。本实验为探讨禽网状内皮组织增生症病毒感染的免疫抑制机理打下了一定基础。

论文目录

• 符号说明
• 中文摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 白细胞介素18 的研究进展
• 1.1.1 IL-18 基因结构及其表达的调节
• 1.1.2 IL-18 的表达
• 1.1.3 IL-18 的受体与信号转导
• 1.1.4 IL-18 与机体防御
• 1.1.4.1 抗细菌感染
• 1.1.4.2 抗病毒感染
• 1.1.4.3 抗真菌、原虫和寄生虫感染
• 1.1.4.4 在自动免疫和炎症疾病中的作用
• 1.1.4.5 抗肿瘤作用
• 1.2 鸡白细胞介素18 的研究进展
• 1.2.1 ChIL-18 的分子生物学特性
• 1.2.2 ChIL-18 的生物学功能
• 1.2.2.1 诱导IFN-γ以及多种细胞因子的产生
• 1.2.2.2 免疫增强剂和抗感染作用
• 1.2.2.3 抗肿瘤作用
• 1.2.3 ChIL-18 的应用前景
• 1.2.3.1 免疫系统的保护作用
• 1.2.3.2 对感染性疾病的治疗作用
• 1.3 REV 研究进展
• 1.3.1 病原学
• 1.3.2 流行病学
• 1.3.3 免疫抑制机理
• 1.3.3.1 免疫器官造成严重的器质性伤害
• 1.3.3.2 减少免疫活性细胞的数量
• 1.3.3.3 抑制免疫活性细胞的活性
• 1.3.3.4 通过影响一些免疫活性因子的活性造成免疫抑制
• 1.3.3.5 对部分病原微生物易感性增强
• 1.3.4 症状及病理变化
• 1.3.4.1 急性网状细胞肿瘤形成
• 1.3.4.2 矮小病综合症
• 1.3.4.3 慢性肿瘤形成
• 1.3.4.4 防制
• 1.4 细胞因子的检测
• 1.4.1 细胞因子检测的意义
• 1.4.2 细胞因子检测方法
• 1.4.2.1 分子生物学检测方法
• 1.4.2.2 生物学活性检测方法
• 1.4.2.3 免疫学检测方法
• 1.4.3 鸡病毒性免疫抑制病中细胞因子的检测
• 1.4.3.1 MDV 感染对鸡细胞因子产生的影响
• 1.4.3.2 REV 感染对鸡细胞因子产生的影响
• 1.4.3.3 CAV 感染对鸡细胞因子产生的影响
• 1.4.3.4 IBDV 感染对鸡细胞因子产生的影响
• 1.4.3.5 NDV 感染对鸡细胞因子产生的影响
• 1.4.3.6 其它病毒感染对鸡细胞因子产生的影响
• 1.5 实时荧光定量PCR 研究进展
• 1.5.1 实时荧光定量PCR 的原理
• 1.5.2 实时荧光定量PCR 的分类
• 1.5.2.1 TaqMan 探针法
• 1.5.2.2 SYBR GreenI 荧光染料法
• 1.5.2.3 TaqMan MGB 探针
• 1.5.2.4 分子信标
• 1.5.2.5 双杂交探针
• 1.5.3 实时荧光定量PCR 的定量方法
• 1.5.3.1 绝对定量
• 1.5.3.2 相对定量
• 1.5.4 实时荧光定量PCR 的应用
• 1.5.4.1 病原体的分子检测
• 1.5.4.2 肿瘤的分子诊断
• 1.5.4.3 细胞因子的表达分析
• 1.5.4.4 基因表达研究
• 1.5.4.5 转基因研究
• 1.5.4.6 结语
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株与载体
• 2.1.2 实验动物与病毒
• 2.1.3 试剂与耗材
• 2.1.4 仪器与设备
• 2.1.5 实验室常用各种培养基和溶液的配制
• 2.1.5.1 LB 液体培养基
• 2.1.5.2 LB／Amp／X-gal／IPTG 平板培养基
• 2.1.6 引物设计及合成
• 2.2 方法
• 2.2.1 鸡白细胞介素18 SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR 方法的建立
• 2.2.1.1 IL-18 部分基因重组质粒的构建
• 2.2.1.2 RPL4 部分基因重组质粒的构建
• 2.2.1.3 荧光定量PCR 反应条件的摸索及标准曲线的建立
• 2.2.2 鸡白细胞介素18 TaqMan 探针荧光定量RT-PCR 方法的建立错误
• 2.2.2.1 PCR 反应体系
• 2.2.2.2 荧光定量PCR 反应条件的摸索及标准曲线的建立
• 2.2.3 REV 对1 日龄普通肉鸡的致病性观察
• 2.2.3.1 人工感染
• 2.2.3.2 统计学分析
• 2.2.4 实时荧光定量RT-PCR 检测REV 感染肉鸡主要免疫器官IL-18 基因表达量的研究
• 2.2.4.1 动物实验处理
• 2.2.4.2 RNA 的提取
• 2.2.4.3 RT 反应
• 2.2.4.4 实时荧光定量PCR 检测不同时间点脾脏IL-18 基因m RNA 的转录水平
• 2.2.4.5 数据处理与分析
• 3 结果与分析
• 3.1 鸡白细胞介素18 SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR 方法的建立
• 3.1.1 IL-18 部分基因重组质粒的构建结果
• 3.1.1.1 IL-18 部分基因的PCR 扩增电泳图
• 3.1.1.2 IL-18 基因片段重组质粒的酶切结果
• 3.1.1.3 测序结果
• 3.1.2 RPL4 部分基因重组质粒的构建结果
• 3.1.2.1 RNA 电泳图
• 3.1.2.2 RNA 的提取效果
• 3.1.2.3 RPL4 部分基因的RT-PCR 扩增电泳图
• 3.1.2.4 RPL4 基因片段重组质粒的酶切结果
• 3.1.2.5 测序结果
• 3.1.3 荧光定量 PCR 建立的结果
• 3.1.3.1 标准品的处理效果
• 3.1.4 SYBR GreenⅠ实时荧光定量 PCR 的建立
• 3.1.4.1 SYBR GreenⅠ实时荧光定量 PCR 扩增动力学曲线
• 3.1.4.2 SYBR GreenⅠ实时荧光定量 PCR 扩增熔解曲线
• 3.1.4.3 荧光定量 PCR 检测 IL-18 和 RPL4 敏感度分析
• 3.1.4.4 荧光定量 PCR 检测 IL-18 和 RPL4 重复性分析
• 3.1.4.5 SYBR GreenⅠ实时荧光定量 PCR 扩增的标准曲线
• 3.2 鸡白细胞介素18 TaqMan 探针荧光定量RT-PCR 方法的建立
• 3.2.1 IL-18 和RPL4 部分基因的RT-PCR 扩增电泳图
• 3.2.2 标准品的处理效果
• 3.2.2.1 标准品的浓度及纯度
• 3.2.2.2 标准品浓度的选择结果
• 3.2.3 实时荧光定量PCR 的建立
• 3.3 REV 对1 日龄普通肉鸡的致病性观察
• 3.3.1 临床症状
• 3.3.2 死亡统计
• 3.3.3 增重影响
• 3.3.4 免疫器官指数影响
• 3.3.4.1 脾脏指数
• 3.3.4.2 胸腺指数
• 3.3.4.3 法氏囊指数
• 3.4 实时荧光定量 RT-PCR 检测 REV 感染肉鸡主要免疫器官 IL-18 基因表达 量的研究
• 4 讨论
• 4.1 鸡白细胞介素18 SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR 方法的建立
• 4.2 鸡白细胞介素18 TaqMan 探针荧光定量RT-PCR 方法的建立
• 4.3 REV 对1 日龄普通肉鸡的致病性观察
• 4.4 实时荧光定量 RT-PCR 检测 REV 感染肉鸡主要免疫器官 IL-18 基因表达量的研究
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况
• 硕士学位论文内容简介及自评