糖尿病肝损伤防治的初步研究

论文摘要

糖尿病已成为影响人们生活质量的一种重要疾病,我国糖尿病患者的总人数居世界前列,肝脏在糖尿病发生的病理生理过程中占重要位置,因此,糖尿病患者的肝损伤应该引起足够的重视。谷胱甘肽（GSH）,具有较强的抗氧化作用,临床上已初步用于糖尿病神经病变、糖尿病脂肪肝等的防治,但GSH在防治糖尿病肝损伤的机制尚不清楚。积雪草酸（AA）具有多方面的药理作用:抗氧化、抗炎、神经保护和抑制肿瘤细胞增殖等,但积雪草酸用于糖尿病及其并发症尚未见报道。目的:分析镇江某医院糖尿病患者的临床数据,了解糖尿病肝损伤的发生率、病理及临床特点。探讨内源性抗氧化剂GSH和天然化合物AA对STZ诱导的1型糖尿病大鼠肝损伤的防治作用及可能机制。方法:统计临床糖尿病患者的资料:①一般资料:性别、年龄、糖尿病病程、临床表现、糖尿病并发症诊断结果。②人体学指标:身高、体重。③生化指标:空腹血糖（FBG）、糖化血红蛋白（HbAlc）、胆固醇（TC）、甘油三脂（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL-C）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、总胆红素（BIL）、γ-谷氨酰转肽酶（GGT）和碱性磷酸酶（ALP）。④肝脏B超。分析糖尿病患者糖尿病肝损伤的发病机制、临床病理特点。设置对照组（NC）,另用65 mg·kg-1链脲佐菌素（STZ）腹腔注射建立糖尿病大鼠模型,成模后将其分为糖尿病（DM）组,DM+GSH组。灌胃给药8周后分离血清、肝脏,检测血清TG、TC、HDL-C、LDL、ALT、AST、TBIL、直接胆红素（DBIL）水平,分析血清和肝脏组织的超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）含量或活力,检测各组大鼠肝脏线粒体对肿胀模型的敏感性和线粒体膜电位（ΔΨm）,HE染色观察肝脏组织形态。免疫组化分析线粒体外膜蛋白VDAC的表达。体外fenton反应研究AA清除羟自由基的能力,MTT法研究其对正常肝细胞和肝肿瘤细胞增殖的影响,建立CCl4诱导的小鼠急性肝损伤模型,从血清的ALT、AST活力和肝组织的MDA、GSH含量比较等方面检测其保肝作用。建立糖尿病大鼠模型,设置对照组（control）,DM组,低、中、高剂量(10 mg·kg-1、20 mg·kg-1、40 mg·kg-1)AA干预组,20 mg·kg-1硫辛酸（LA）阳性对照组。灌胃给药8周后分离血清、肝脏,检测指标与GSH干预DM大鼠的研究相同。此外,研究了AA对糖尿病大鼠肝线粒体的影响。结果:经筛选选取糖尿病患者274例,1型糖尿病31例,2型243例。绝大部分患者表现有典型糖尿病症状。B超检查发现2型糖尿病患者中检出肝功异常者96例,占40%,主要为脂肪肝。1型糖尿病患者肝功指标紊乱较少,仅3%～26%。2型糖尿病患者肝功异常比例占糖尿病患者总数的10%-30%,其中GGT异常所占比例最高。1型糖尿病患者血脂异常比例约为10%。2型糖尿病患者LDL-C、TG、TC异常比例占糖尿病患者总数的14.81%、40.33%、17.7%,其中女性患者血脂紊乱程度稍高。同时,伴有肝损伤患者血浆TG、TC紊乱程度显著高于肝正常患者。糖尿病超重和肥胖患者易并发肝损伤,肝损伤患者与肝正常患者的体重分布相比有显著性差异。DM大鼠空腹血糖、LDL-C、TC、TG含量较正常组有显著升高,血清ALT、AST、BIL、LDH水平升高,血清和肝脏的SOD活力下降、MDA含量升高,肝脏线粒体膜电位下降、对Ca2+诱导的肿胀敏感度下降。HE染色发现糖尿病大鼠肝细胞增大、出现空泡等病理情况。免疫组化显示,肝线粒体外膜VDAC蛋白表达量降低。GSH能够显著抑制以上各项指标的变化。200、500、1000μmol·L-1AA具有清除羟自由基的活性,呈剂量依赖性。20、30、40μmol·L-1的AA抑制HepG2细胞增殖,改变细胞形态,1、10 nmol·L-1的AA改善300μmol·L-1H2O2诱导的WRL-68细胞损伤。CCl4急性肝损伤小鼠血清ALT、AST水平升高,肝脏MDA含量升高,线粒体受到损伤,AA能够显著降低ALT、AST、MDA等的升高。糖尿病大鼠肝功指标紊乱,AA能够一定程度上抑制各项指标的变化。结论:临床资料表明糖尿病肝损伤比例约为30%。B超检查是临床肝功检测的有效手段之一,肝功指标以GGT、ALT升高最为敏感,血脂指标以TG、TC紊乱最为突出,且与肥胖相关。GSH对糖尿病大鼠肝脏损伤具有明显的改善作用,其作用可能与调节血脂代谢、调节肝脏氧化还原平衡、保护肝脏线粒体以及影响VDAC表达有关。AA具有清除羟自由基的作用。AA对肝癌细胞具有抑制作用,对H2O2损伤的正常肝细胞具有保护作用,AA能够抑制线粒体发生肿胀。AA对CCl4导致的小鼠急性肝损伤具有一定的治疗作用,其作用机制可能与其对抗氧化应激、保护线粒体相关。AA对糖尿病大鼠肝脏氧化还原平衡紊乱有一定程度的改善,为应用于糖尿病肝损伤的防治提供了实验依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 糖尿病
• 1.2 糖尿病肝损伤
• 1.3 自由基、氧化应激与糖尿病
• 1.4 氧化抗氧化系统与糖尿病
• 1.5 线粒体与糖尿病
• 1.6 积雪草酸的药理作用
• 1.8 课题研究目的
• 第二章 糖尿病肝损伤的临床情况
• 2.1 对象和方法
• 2.1.1 对象
• 2.1.2 研究方法
• 2.1.3 诊断标准
• 2.1.4 统计学处理
• 2.2 结果
• 2.2.1 糖尿病临床表现
• 2.2.2 糖尿病性脂肪肝
• 2.2.3 糖尿病相关性肝功异常
• 2.2.4 糖尿病相关性血脂异常
• 2.2.5 糖尿病相关性肝损伤与体重分布的关系
• 2.3 讨论与小结
• 第三章 谷肤甘肤保护糖尿病大鼠肝脏的初步研究
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 实验动物
• 3.1.2 药物与试剂
• 3.1.3 仪器与设备
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 建立大鼠糖尿病模型
• 3.2.2 动物分组及处理
• 3.2.3 一般状态观察
• 3.2.4 样本收集与制备
• 3.2.5 血清生化指标测定
• 3.2.6 组织蛋白含量测定
• 3.2.7 MDA、SOD含量或活力测定
• 3.2.8 肝脏病理学观察
• 3.2.9 鼠肝脏线粒体功能检测
• 3.2.10 统计学处理
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 糖尿病大鼠模型的制备
• 3.3.2 一般状态观察
• 3.3.3 GSH对糖尿病大鼠血清中血脂代谢参数的影响
• 3.3.4 GSH对糖尿病大鼠血清中肝功指标的影响
• 3.3.5 GSH对糖尿病大鼠血清、肝组织氧化应激的影响
• 3.3.6 GSH对糖尿病大鼠肝脏线粒体的保护
• 3.3.7 GSH对糖尿病大鼠肝脏组织学的影响
• 3.4 讨论与小结
• 第四章 积雪草酸防治糖尿病肝损伤的初步研究
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 细胞株
• 4.1.2 实验动物
• 4.1.3 主要试剂
• 4.1.4 仪器与设备
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 体外清除轻自由基（·OH）试验
• 4.2.2 细胞培养
• 4.2.3 姗法测细胞活性
• 2+诱导的线粒体肿胀度的测定'>4.2.4 Ca²⁺诱导的线粒体肿胀度的测定
• 4诱导肝损伤的研究'>4.2.5 AA保护小鼠对抗CCl₄诱导肝损伤的研究
• 4.2.6 AA保护大鼠对抗STZ诱导肝损伤的研究
• 4.2.7 样本采集与制备
• 4.2.8 指标检测方法
• 4.2.9 统计方法
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 AA体外清除经自由基（·OH）
• 4.3.2 AA对肝肿瘤细胞和正常肝细胞增殖的影响
• 2+诱导的线粒体肿胀'>4.3.3 AA抑制Ca²⁺诱导的线粒体肿胀
• 4损伤小鼠体重变化和肝脏指数的影响'>4.3.4 AA对CCl₄损伤小鼠体重变化和肝脏指数的影响
• 4诱导的急性肝损伤小鼠血清中ALT、AST的影响'>4.3.5 AA对CCl₄诱导的急性肝损伤小鼠血清中ALT、AST的影响
• 4诱导的急性肝损伤小鼠肝脏MDA含量的影响'>4.3.6 AA对CCl₄诱导的急性肝损伤小鼠肝脏MDA含量的影响
• 4.3.7 AA对糖尿病大鼠一般状况的影响
• 4.3.8 AA对糖尿病大鼠血清中肝功指标的影响
• 4.3.9 AA对糖尿病大鼠肝组织GSH、MDA含量的影响
• 4.3.10 AA对糖尿病大鼠肝脏线粒体肿胀的影响
• 4.4 讨论与小结
• 第五章 结论与展望
• 5.1 实验结论
• 5.2 实验展望
• 致谢
• 参考文献
• 在学期间发表的论文