共价连接法固定化β-半乳糖苷酶及其应用研究

论文摘要

本论文以环氧基改性的D152阳离子交换树脂为载体通过共价连接的方法固定β-半乳糖苷酶。与传统的共价法固定酶相比较，本法具有固定条件温和、操作工艺简单和酶与载体结合牢固等优点，而且所得固定化酶具有良好的稳定性和重复使用性。文中对β-半乳糖苷酶的固定化条件、固定化酶的性质以及固定化酶水解乳糖的动力学进行了系统研究。1.固定化条件研究研究了（NH4）2SO4浓度、加酶量、pH值、温度和时间对改性D152阳离子交换树脂固定β-半乳糖苷酶的影响，并用红外光谱和扫描电镜表征了固定化β-半乳糖苷酶的结构。结果表明：在（NH4）2SO4浓度1.75mol·L-1，加酶量1.54U·g-1，pH6.5，温度35℃和时间4h的条件下，固定化β-半乳糖苷酶比活力和活力回收率分别为0.127U·g-1和8.25%。2.固定化酶的性质研究（1）动力学：研究了时间、底物浓度、pH值、温度、激活剂与抑制剂对固定化β-半乳糖苷酶催化ONPG水解反应速率的影响。结果表明：固定化β-半乳糖苷酶催化ONPG水解的最适pH值和温度分别为6.57.5和3545℃；Km为245.652μmol·L-1；Ca2+、Mn2+和Fe2+在<10-3mol·L-1时有激活作用；Mg2+在<10-5mol·L-1时有激活作用，在>10-4mol·L-1时有抑制作用；Zn2+在<10-5mol·L-1或>10-4mol·L-1时起激活作用；Cu2+在<10-5mol·L-1或>10-4mol·L-1时起抑制作用。（2）稳定性：研究了pH值、温度、时间和操作对固定化β-半乳糖苷酶稳定性的影响。结果表明：固定化酶适宜在pH7.5，且低于20℃的环境中保存；固定化酶在pH7.5，5℃时半衰期为32d，20℃时半衰期为28d；批次操作稳定性较好，连续反应10次后固定化酶活力保持在85%以上。3.固定化酶水解乳糖的动力学研究研究了乳糖浓度、pH值、温度和时间对固定化β-半乳糖苷酶催化乳糖水解反应速率的影响。结果表明：固定化酶催化乳糖水解的最适pH值和温度分别为7.0和35℃，Km为649.314μmol·L-1；酶活性降为水解ONPG时的约1/25；乳糖水解率与反应时间之间显著地呈正线性相关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 正文目录
• 第一章 文献综述
• 1 β-半乳糖苷酶简介
• 2 β-半乳糖苷酶的应用
• 3 固定化β-半乳糖苷酶的研究现状及应用
• 4 乳糖不耐症
• 4.1 乳糖不耐症的类型
• 4.2 乳糖不耐症的解决办法与预防措施
• 5 固定化酶研究进展
• 5.1 固定化酶的含义
• 5.2 固定化酶的特点
• 5.3 固定化酶的性质
• 5.4 固定化酶的应用
• 6 固定化酶的载体和方法
• 6.1 固定化酶的载体
• 6.2 固定化酶的方法
• 7 研究的内容
• 第二章 β-半乳糖苷酶的固定化研究
• 1 材料、试剂与仪器
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.3 主要仪器设备
• 2 方法
• 2.1 固定化β-半乳糖苷酶载体的制备
• 2.2 β-半乳糖苷酶酶活力及反应速率的测定方法
• 2.2.1 邻硝基酚标准曲线的制作
• 2.2.2 相关定义
• 2.2.3 游离酶比活力及反应速率的测定
• 2.2.4 固定化酶比活力及反应速率的测定
• 2.3 固定β-半乳糖苷酶的条件优化
• 4）₂SO₄浓度对β-半乳糖苷酶固定化的影响'>2.3.1 （NH₄）₂SO₄浓度对β-半乳糖苷酶固定化的影响
• 2.3.2 加酶量对β-半乳糖苷酶固定化的影响
• 2.3.3 pH值对β-半乳糖苷酶固定化的影响
• 2.3.4 温度对β-半乳糖苷酶固定化的影响
• 2.3.5 反应时间对β-半乳糖苷酶固定化的影响
• 2.4 固定化β-半乳糖苷酶酶的结构表征
• 2.4.1 固定化β-半乳糖苷酶的扫描电镜分析
• 2.4.2 固定化β-半乳糖苷酶的红外光谱分析
• 3 结果与讨论
• 3.1 固定β-半乳糖苷酶的条件优化
• 4）₂SO₄浓度对β-半乳糖苷酶固定化的影响'>3.1.1 （NH₄）₂SO₄浓度对β-半乳糖苷酶固定化的影响
• 3.1.2 加酶量对β-半乳糖苷酶固定化的影响
• 3.1.3 pH值对β-半乳糖苷酶固定化的影响
• 3.1.4 温度对β-半乳糖苷酶固定化的影响
• 3.1.5 反应时间对β-半乳糖苷酶固定化的影响
• 3.1.6 最优条件下固定β-半乳糖苷酶
• 3.2 固定化β-半乳糖苷酶的结构表征
• 3.2.1 固定化β-半乳糖苷酶的扫描电镜
• 3.2.2 固定化β-半乳糖苷酶的红外光谱
• 4 结论
• 第三章 固定化β-半乳糖苷酶的性质研究
• 1 材料、试剂与仪器
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器设备
• 2 方法
• 2.1 固定化β-半乳糖苷酶的动力学研究
• 2.1.1 固定化β-半乳糖苷酶催化ONPG水解的进程曲线
• 2.1.2 底物浓度对固定化β-半乳糖苷酶催化化学反应速率的影响
• 2.1.3 pH值对固定化β-半乳糖苷酶催化化学反应速率的影响
• 2.1.4 温度对固定化β-半乳糖苷酶催化化学反应速率的影响
• 2.1.5 金属离子对固定化β-半乳糖苷酶活性的影响
• 2.2 固定化β-半乳糖苷酶的稳定性研究
• 2.2.1 固定化β-半乳糖苷酶的热稳定性
• 2.2.2 固定化β-半乳糖苷酶的酸碱稳定性
• 2.2.3 固定化β-半乳糖苷酶的操作稳定性
• 2.2.4 固定化β-半乳糖苷酶的贮藏稳定性
• 3 结果与讨论
• 3.1 固定化β-半乳糖苷酶的动力学
• 3.1.1 固定化β-半乳糖苷酶催化ONPG水解的进程曲线
• 3.1.2 底物浓度对固定化β-半乳糖苷酶催化化学反应速率的影响
• 3.1.3 pH值对固定化β-半乳糖苷酶催化化学反应速率的影响
• 3.1.4 温度对固定化β-半乳糖苷酶催化化学反应速率的影响
• 3.1.5 金属离子对固定化β-半乳糖苷酶活性的影响
• 3.2 固定化β-半乳糖苷酶的稳定性
• 3.2.1 固定化β-半乳糖苷酶的热稳定性
• 3.2.2 固定化β-半乳糖苷酶的酸碱稳定性
• 3.2.3 固定化β-半乳糖苷酶的操作稳定性
• 3.2.4 固定化β-半乳糖苷酶的贮藏稳定性
• 4 结论
• 第四章 固定化β-半乳糖苷酶催化乳糖水解动力学研究
• 1 材料、试剂与仪器
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器设备
• 2 方法
• 2.1 葡萄糖标准曲线的制作
• 2.2 固定化β-半乳糖苷酶催化乳糖水解反应速率的测定
• 2.3 固定化β-半乳糖苷酶催化乳糖水解动力学研究
• 2.3.1 底物浓度对固定化β-半乳糖苷酶催化乳糖水解反应速率的影响
• 2.3.2 pH值对固定化β-半乳糖苷酶催化乳糖水解反应速率的影响
• 2.3.3 温度对固定化β-半乳糖苷酶催化乳糖水解反应速率的影响
• 2.3.4 固定化β-半乳糖苷酶催化乳糖水解的水解曲线
• 3 结果与讨论
• 3.1 底物浓度对固定化β-半乳糖苷酶催化乳糖水解反应速率的影响
• 3.2 pH值对固定化β-半乳糖苷酶催化乳糖水解反应速率的影响
• 3.3 温度对固定化β-半乳糖苷酶催化乳糖水解反应速率的影响
• 3.4 固定化β-半乳糖苷酶催化乳糖水解的水解曲线
• 4 结论
• 参考文献
• 论文发表
• 致谢