石房蛤毒素及其抗体适配子的制备与检测方法的建立

论文摘要

石房蛤毒素（Saxitoxin，STX）是一种毒性极强的胍胺类神经毒素，是有害赤潮发生过程海水中一种重要的致害因子。STX主要来源于海水或淡水中某些有害浮游生物的二次代谢产物，并通过食物链蓄积于贝类、蟹类等水产品中。当人类或动物摄食被毒素污染的水产品，就会引起麻痹、死亡等中毒反应。近年来，海洋污染问题日益严重，有害藻华（HAB）和赤潮频繁发生，致使有毒水产品中毒事件在世界范围内时有发生。为了保障公众的身体健康不受毒素隐患的威胁，必须加强对STX等贝类毒素的检测和监管工作。目前，STX的检测方法主要有生物毒性试验法、高效液相色谱分析法，细胞毒性试验法，免疫学测定法等，这些检测方法都存在一定的缺陷和不足。如试验不够灵敏，需要昂贵的设备仪器及高素质的操作人员，毒素标准品价格昂贵等。为解决以上问题迫切需要寻找一种灵敏、特异、方便、无毒的STX检测方法。本研究旨在利用STX和STX单抗为靶标分子，通过SELEX技术筛选STX和STX单抗的特异性适配子，建立基于适配子的STX无毒ELISA检测方法，为深化我国海洋环境学研究和开发具有自主知识产权的无毒快速检测试剂盒提供试验基础。为了筛选STX特异性适配子，我们设计并合成了一个长度为81个核苷酸的ssDNA文库，文库的中间含有40个碱基的随机序列，两端为固定序列。同时，设计一段与ssDNA文库固定序列部分互补的固定探针，该核酸分子的末端依据微孔板表面的化学基团进行相应化学修饰，以便连接固定到微孔板表面。利用固定探针将ssDNA文库固定在微孔板上，以STX为靶标分子，采用靶标诱导变构解离SELEX技术筛选STX的适配子。经过15轮的反复筛选、富集过程，获得与STX高亲和力的适配子富集文库。对富集文库进行PCR扩增、连接、转化和克隆测序。通过DNAMAN软件和mfold网站对获得的适配子序列进行一级结构同源性分析及二级结构预测。通过间接ELISA和竞争ELISA方法对获得的适配子序列进行亲和力和特异性分析，最终获得3个具有较高特异性和亲和力的STX适配子。同时，我们采用微孔板SELEX技术对STX抗体F（ab′）2片段适配子进行了筛选。经过16轮的反复筛选、富集过程，获得与STX抗体F（ab′）2片段高亲和力的适配子富集文库。对富集文库进行PCR扩增、连接、转化和克隆测序。通过DNAMAN软件和mfold网站对获得的适配子序列进行一级结构同源性分析及二级结构预测。通过间接ELISA和竞争ELISA方法对获得的适配子序列进行亲和力和特异性分析，并采用超滤和竞争ELISA方法对以上鉴定的优势适配子的复合物形成能力和特异性进一步分析，最终成功获得了一个能够模拟STX与STX抗体结合的适配子。基于靶标诱导变构解离SELEX筛选模式，我们设计了一种适配子变构解离的STX无毒ELISA检测方法。利用STX与STX适配子能够特异性结合而发生构象改变的原理，结合微孔板核酸杂交技术和生物素-亲和素-辣根过氧化物酶显色系统实现对STX的无毒检测。并对该检测方法中固定探针长度、适配子浓度、洗涤缓冲液中盐离子浓度等条件进行了优化，完成标准工作曲线绘制，得到线性回归方程为y=-6.4916x+99.006，相关系数R2=0.9959，线性检测范围为3.92～1600ng/mL，最低检测限为3.92ng/mL。此外，我们对STX与STX抗体适配子对应关系进行了线性回归分析，分析表明STX标准品浓度与STX抗体适配子浓度之间有相关性，为建立STX抗体适配子替代STX的ELISA检测方法奠定基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 第一篇 文献综述
• 第1章 石房蛤毒素的研究进展
• 1.1 STX 的来源及分布
• 1.2 STX 及其类似物的结构及性质
• 1.3 STX 的提取
• 1.4 STX 的合成
• 1.5 STX 的代谢动力学
• 1.6 STX 的检测方法
• 1.7 STX 的作用机制及应用
• 1.8 展望
• 第2章 适配子在诊断学、食品安全及环境中的应用
• 2.1 适配子及 SELEX 技术
• 2.2 Aptamer 在环境分析和食品控制中的应用
• 2.3 Aptamer 在诊断中的应用
• 2.4 展望
• 第二篇 研究内容
• 第1章 STX 适配子的筛选
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.3 结果
• 1.4 讨论
• 1.5 小结
• 第2章 STX 适配子的鉴定及二级结构分析
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第3章 STX 抗体适配子的筛选
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第4章 STX 抗体适配子的鉴定及二级结构分析
• 4.1 材料
• 4.2 方法
• 4.3 结果
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 第5章 适配子在 STX 无毒检测方法中的初步应用
• 5.1 材料
• 5.2 方法
• 5.3 结果
• 5.4 讨论
• 5.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 导师简介
• 作者简介
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢