利用黑线鳕和狭鳕加工副产品制备胶原的表征及其功能评价

论文摘要

海洋动物胶原蛋白,特别是鱼皮胶原逐渐受到人们的关注。由于鱼类属于变温动物,与哺乳动物胶原相比拥有独特的氨基酸组成,因此鱼皮胶原蛋白有若干特殊性质。为了使以水产加工的副产品得到充分的利用,本文以廉价易得的水产加工下脚料黑线鳕（Melanogrammus aeglefinus）和狭鳕（Theragra chalcogramma）鱼皮为原料,提取了酸溶胶原（Acid-soluble collagen, ASC）。通过对多种预处理和提取方法的对比选择出了优化的制备方法。利用酸和酶作为催化剂研究了ASC的水解与产物分子量之间的关系。并利用小鼠和鸡胚以及毛发为模型,分别研究了两种鱼皮酸溶胶原及其部分水解物的体内和体外功能特性。除机械剪切以外,分别用微波处理和超声波的预处理方法,在三种温度条件下用乙酸溶液对黑线鳕和狭鳕鱼皮原料进行ASC提取。经比较产率和产品的性质特征,优化的制备条件为,半时间歇超声处理120 s,20℃下用0.5 M乙酸溶液提取,两种鱼皮ASC的产率分别达到15.05%和13.11%,产品符合胶原的典型特征且纯度较高,原有结构保持较好。对制得的黑线鳕和狭鳕鱼皮ASC进行了基本性质表征,紫外光谱显示二者分别在233 nm和230 nm处有最大光吸收。傅立叶变换红外光谱表明所提取的两种胶原保持了原有的螺旋结构。氨基酸组成显示黑线鳕和狭鳕鱼皮ASC的甘氨酸分别达21.1%和19.8%,羟脯氨酸分别约占7.8%和6.9%,组成与其它一些鱼类ASC有相似之处。通过凝胶电泳分析,确定两种胶原由至少2种不同的α肽链组成,均被鉴定为I型胶原蛋白。此外,黑线鳕和狭鳕鱼皮ASC的热变性温度相差不大,均较陆生动物低,并显示出与羟脯氨酸含量的相关性。利用三种不同浓度酸和三种不同的蛋白酶分别对黑线鳕和狭鳕鱼皮ASC进行水解。黑线鳕和狭鳕鱼皮ASC的酸水解物分子量范围分别是3.5-53.4 kDa和2.6-46.4 kDa。黑线鳕和狭鳕鱼皮ASC酶水解物的平均分子量范围分别是6.8-37.1 kDa和5.9-31.2 kDa。酶促水解中,酶活性、反应时间和水解物平均分子量的关系比酸水解复杂,酸水解更具有随机性,生成物平均分子量稳定。从两种鱼皮胶原的酸水解物中,选择两组具有平均分子量由大到小梯度的水解物1-4与两种ASC共同进行功能评价。体内功能实验中,黑线鳕和狭鳕鱼皮ASC及水解物1和2显示出明显的止血功能和促凝功能,其中,黑线鳕鱼皮ASC及其水解物1分别缩短凝血时间达26.5%和22.9%;狭鳕鱼皮ASC及其水解物1分别缩短27.0%和19.1%。外伤愈合实验中,黑线鳕鱼皮ASC及其水解物最高可缩短小鼠外伤愈合时间达30.4%,狭鳕及其水解物1也分别缩短愈合时间26.1%和21.7%。烫伤修复实验中,两种鱼皮ASC及各自水解物均显示出一定的积极作用但程度不同,其中用各自较低分子量的水解物3和4处理过的小鼠皮肤组织修复迹象最明显。血管生成实验表明,黑线鳕鱼皮ASC及其水解物1和狭鳕鱼皮ASC的处理对鸡胚尿囊膜（Chick embryo chorioallantoic membrane, CAM）有促进血管生成的作用,其主要方式是促进CAM中毛细血管床的血管分支及小血管发生,且对胚胎未见毒害作用。体外功能实验中,黑线鳕鱼皮ASC的低分子量水解物3和4经处理1h后的头发在强度和拉伸率上有较明显的改善。狭鳕鱼皮ASC的低分子量水解物则需对头发处理2 h以上才有效。体外凝血实验中,黑线鳕和狭鳕鱼皮ASC均对凝血形态有显著影响,引发形成纤维状凝血块,其各自的大分子量水解物1形成与之类似但体积更小的凝血块。两种鱼皮ASC均在离体皮肤保湿中显示出良好性能,保湿性随平均分子量降低而下降。类似的,ASC及其水解物的吸水性和吸油性也随平均分子量的降低而下降。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 0 前言
• 0.1 胶原的概述
• 0.1.1 胶原的组成及结构
• 0.1.2 胶原蛋白的提取制备
• 0.1.2.1 酸提取法
• 0.1.2.2 碱提取法
• 0.1.2.3 酶提取法
• 0.1.2.4 盐提取法
• 0.1.2.5 水提取法
• 0.1.2.6 胶原蛋白的分离纯化
• 0.1.3 胶原蛋白的特性
• 0.1.3.1 胶原蛋白的氨基酸组成
• 0.1.3.2 胶原蛋白的热稳定性
• 0.1.3.3 胶原蛋白的成凝胶特性
• 0.1.4 鱼类胶原蛋白
• 0.1.4.1 鱼类胶原的氨基酸组成
• 0.1.4.2 鱼类胶原的结构和特性
• 0.2 胶原蛋白的应用
• 0.2.1 胶原的性能及其应用
• 0.2.2 胶原蛋白在食品上的应用
• 0.2.3 胶原蛋白在化妆品领域的应用
• 0.2.4 胶原蛋白在医学领域的应用
• 0.3 水解胶原蛋白多肽的活性及其应用
• 0.3.1 胶原多肽的生物学活性
• 0.3.2 胶原多肽的护肤作用
• 0.3.3 胶原多肽在食品工业的应用
• 0.4 研究的目的与意义
• 1. 黑线鳕和狭鳕鱼皮胶原的提取制备和基本性质表征
• 1.1 实验材料与仪器
• 1.1.1 实验材料与试剂
• 1.1.2 实验仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 原料的预处理
• 1.2.2 鱼皮胶原的提取
• 1.2.3 氨基酸含量及组成分析
• 1.2.4 紫外-可见（UV-Vis） 光谱分析
• 1.2.5 傅立叶变换红外光谱（FTIR） 分析
• 1.2.6 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
• 1.2.7 热稳定性分析
• 1.2.8 工艺条件的优化.
• 1.3 结果与讨论
• 1.3.1 氨基酸含量及组成分析
• 1.3.2 紫外-可见光谱分析
• 1.3.3 傅立叶变换红外光谱（FTIR） 分析
• 1.3.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 1.3.5 热变性温度
• 1.3.6 提取条件的优化
• 1.4 小结
• 2. 鱼皮胶原的水解及水解物分子量
• 2.1 实验材料与仪器
• 2.1.1 实验材料与试剂
• 2.1.2 实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 胶原的酸促水解
• 2.2.2 胶原的酶促水解
• 2.2.2.1 蛋白酶比活力的测定
• 2.2.2.2 胶原蛋白的酶水解
• 2.2.3 水解产物的平均分子量测定
• 2.2.4 水解度分析
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 酶比活力测定
• 2.3.2 酸水解产物的平均分子量分布
• 2.3.3 酶水解产物的平均分子量分布
• 2.3.4 水解度分析
• 2.4 小结
• 3. 胶原和胶原水解物的体内功能研究
• 3.1 实验材料与仪器
• 3.1.1 实验材料与试剂
• 3.1.2 实验仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 胶原水解物试液制备
• 3.2.2 对小鼠出血时间的影响
• 3.2.3 对小鼠凝血时间的影响
• 3.2.4 对小鼠外伤愈合时间的影响
• 3.2.5 小鼠皮肤烫伤修复的组织学分析
• 3.2.6 对鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成的影响
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 对小鼠出血时间的影响
• 3.3.2 对小鼠凝血时间的影响
• 3.3.4 对小鼠外伤愈合时间的影响
• 3.3.5 对小鼠烫伤修复的组织学分析
• 3.3.6 对鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成的影响
• 3.4 小结
• 4. 胶原和胶原水解物的体外功能研究
• 4.1 实验材料与仪器
• 4.1.1 实验材料与试剂
• 4.1.2 实验仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 对头发拉伸强度和拉伸率的影响
• 4.2.2 对小鼠凝血形态的影响
• 4.2.3 对小鼠离体皮肤的保湿作用
• 4.2.4 吸水性和吸油性测定
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 对头发拉伸强度和拉伸率的影响
• 4.3.2 对小鼠体外凝血形态的影响
• 4.3.3 对小鼠离体皮肤的保湿作用
• 4.3.4 吸水和吸油能力测定
• 4.4 小结
• 全文结论
• 本文的创新点
• 不足之处和可持续的研究
• 参考文献
• 致谢
• 附录1
• 附录2