论文摘要
Ⅰ金黄色葡萄球菌肠毒素E的克隆表达和生物活性研究1989年,瑞典科学家White J提出超抗原的概念,它是一类由细菌、病毒、寄生虫产生的对淋巴细胞具有强大刺激功能的蛋白质,由于其对T淋巴细胞的激活能力是普通抗原的2000-50000倍,故称为超抗原。金黄色葡萄球菌肠毒素（staphylococcal enterotoxins,SEs）是目前全世界范围内广泛研究的一种典型的超抗原。与普通抗原不同,肠毒素超抗原首先以完整分子结合于抗原提呈细胞（APC）表面的Ⅱ类主要组织相容性复合体（MHC）的抗原结合沟槽外侧,而后与T细胞表面的抗原受体分子（TCR）的Vβ区结合,形成SE-MHC-TCR三分子复合物后大量激活T细胞。由此激活的T细胞可直接杀伤表达MHC-Ⅱ类分子的肿瘤细胞,而对不表达MHC-Ⅱ类分子的肿瘤细胞也可产生间接的杀伤效应。目前已发现的SEs约有20余种,包括:SEA～SEE、SEG～SEQ及TSST-1等。其中研究最为深入的主要包括A型金黄色葡萄球菌肠毒素（staphylococcalenterotoxin A,SEA）、B型金黄色葡萄球菌肠毒素（staphylococcal enterotoxin B,SEB）、C2型金黄色葡萄球菌肠毒素（staphylococcal enterotoxin C2,SEC2）等,而对其它分型的肠毒素研究较少。E型金黄色葡萄球菌肠毒素（staphylococcalenterotoxin E,SEE）作为一新型肠毒素,具有较好的热稳定性和较低的免疫原性,存在进行进一步研究的价值。为了获得高纯度的SEE蛋白,研究其抗肿瘤活性,本研究试图通过基因工程手段大量表达重组蛋白。从天然产SEE的S.aureus（FRI 326）中扩增得到see基因,克隆至E.coli中大量表达重组SEE（recombinant SEE,rSEE）,通过亲和层析和阴离子交换层析得到纯度高于85%的rSEE,该重组蛋白仅在N端比nSEE多两个氨基酸残基（亮氨酸-谷氨酸,Leu-Glu）。MTT法分析rSEE对T淋巴细胞的增殖作用和体外抗肿瘤效果,结果表明rSEE具有典型的超抗原活性。具超抗原活性的高纯度rSEE,为进一步研究该蛋白的抗肿瘤机制,构建靶向抗肿瘤融合蛋白奠定了基础。1.see基因片段的克隆根据see基因序列设计上下游引物,上游引物5’端引入BamH I酶切位点,下游引物5’端引入Xho I酶切位点和终止密码子。从金黄色葡萄球菌中提取基因组DNA作为模板,进行PCR扩增。将得到的目的片段回收酶切消化后插入pUCm-T克隆载体中。DNA测序确认序列正确的阳性克隆。2.重组pGEX-4T-1-SEE表达质粒的构建提取序列正确的pUCm-T-SEE质粒,用BamH I和Xho I双酶切获取目的片段,插入原核融合蛋白表达质粒pGEX-4T-1。连接产物转化入E.coli DH5α感受态细胞。DNA测序确认序列正确阳性克隆后,将相应质粒转化入表达宿主菌BL21（DE3）。3.重组菌的诱导表达及目标蛋白的可溶性分析挑取阳性菌株于含Amp(100 mg·L-1)的2×YT培养基中,37℃、250 r/min振荡培养过夜。次日按1%接种于新鲜2×YT培养基中,30℃振荡培养3 h至培养物的吸光度(A600)为0.5左右,加入IPTG至终浓度0.1 mmol·L-1,诱导培养过夜。SDS-PAGE电泳分析,发现可溶性目标蛋白质占菌体可溶性蛋白质的40%左右。4.融合蛋白的纯化利用融合蛋白表达载体自带的谷胱甘肽巯基转移酶（GST）标签,采用亲和层析法初步纯化融合蛋白GST-SEE。超声破菌离心后取上清,glutathioneSepharose 4B琼脂糖柱进行亲和纯化,还原型谷胱甘肽溶液洗脱GST-SEE。在融合蛋白GST-SEE中GST和SEE之间含有表达载体自带的凝血酶的酶切位点,纯化后的融合蛋白GST-SEE经过凝血酶16℃酶切16 h。使用超滤换液法(0.05 mol·L-1的Tris-HCl（pH 7.50）)除去酶切液中的小分子物质。取超滤后的蛋白质上样于HiPrep 16/10 Q XL离子柱,上样流速1 mL·min-1,穿透峰中的产物即高纯度的rSEE。5.rSEE的分子筛HPLC纯度检验仪器:Agilent 1100型高效液相色谱仪;色谱柱:Bio-rad Bio-Sil SEC 250-5（300mm×7.8mm）;流动相:TEAN缓冲液（pH 7.0）;流速:0.5 mL·min-1;检测波长:280 nm;进样量:100μL。6.rSEE的生物学活性采用MTT法,以小鼠脾淋巴细胞为靶细胞,肿瘤细胞K562,K562-AD和B16为效应细胞,对纯化所得的rSEE的活性进行检测。结果表明SEE在0.01 mg·L-1浓度时即可显著地刺激脾淋巴细胞的增殖,并且其激活的脾淋巴细胞可有效地抑制肿瘤细胞的生长。综上所述,本课题运用基因工程手段获得了纯度为85%的重组肠毒素rSEE,为制备该蛋白的单克隆和多克隆抗体奠定了基础;MTT法结果表明rSEE具有典型的超抗原活性:低浓度下引起T细胞大量增殖,通过激活T细胞产生显著的体外抗肿瘤效果,为深入研究SEE抗肿瘤原理,靶向抗肿瘤融合蛋白的构建以及肠毒素系列蛋白的平行比较研究打下物质基础。Ⅱ基因组DNA固定化研究细胞内的DNA在内源以及外源DNA损伤物质的攻击下可能会发生突变,我们能够忽视这些突变,而简单地认为个体的基因组DNA在人的一生中保持不变吗?在DNA复制过程中,也会有可遗传突变的发生,而在进行功能基因组比较分析时,我们能够忽视这种突变的存在吗?事实上,由于持续的化学暴露（环境物质,食物等）,我们遗传物质的完整性时刻受到挑战。就算不存在过度的DNA损伤化学物质的暴露,由于内源性的细胞代谢,基因组DNA每天仍然会受到超过20 000次攻击,这些损伤是导致基因突变发生的主要原因。尽管存在DNA修复机制,仍然有大量的DNA损伤成功地躲避了DNA修复机制的检测。在DNA复制过程中,这些DNA损伤往往会引起复制叉的停滞和复制空隙的形成。甚至,有专家指出新分裂的细胞中有1/3的细胞将会发生自发突变。逐渐地,人们开始认识到疾病过程以及人的一生中,基因组DNA并不是一成不变的,研究基因组水平上的动态变化显得越来越有必要。通过这样的研究,人类必将更加清楚地了解疾病的发生,诊断,预防以及治疗。现在认为肿瘤是由易感细胞中遗传损伤的积累造成的。基本上,这些遗传损伤主要是体细胞突变造成的,同时生殖细胞突变也是造成遗传损伤的重要因素。尽管人们试图了解肿瘤发生过程DNA损伤的机制和途径,但是关于DNA损伤如何发生以及潜在影响的研究进展甚微。为了解决这个难题,首先需要准确分辨遗传基础,引起疾病的遗传变化以及旁观遗传变化。所谓遗传基础,即引起疾病发生的最初原因;引起疾病的遗传变化,即引起癌基因复苏获得功能或者使得抑癌基因功能丧失的基因突变;旁观遗传变化,即在疾病发展过程中产生的与疾病发生无关的突变,可作为癌症发生过程中的标志。由于技术瓶颈的制约,对疾病过程中基因组水平上动态变化的系统性的比对研究仍然无法进行。但是,随着DNA测序技术和遗传型判别技术的发展,有两种方法可以作为研究疾病过程中DNA动态变化的备选方案:1.对所有疑似突变位点的SNP进行检测2.全基因组测序。尽管DNA测序技术和遗传型判别技术仍未发展完善,但是保存个体基因组DNA以供现在或者将来研究的需要,显然具有极其重要的现实意义。鉴于样本采集的长期性和不确定性,这项工作刻不容缓,而不是等到所有技术都发展完全以后,再去采集样本获取存在于DNA中的信息。一旦人们预测疾病的能力显著提升,预防疾病发生就成为了可能。由于前瞻性队列研究（Cohort Study）的出现,人们已经开展了对基因组DNA的收集和保存的工作。如果能获得人一生基因组变化的信息并作为医学资料保存下来,这必将能够推动对健康状态,疾病预测,疾病防治以及个性化治疗的认识。然而,基因突变位点数量众多,从人体样本中获得基因组DNA的产量受到限制,我们必须用有限的基因组DNA检测数以百万计的突变位点。科研人员试图建立起高通量平台以实现检测的微型化（0.16 ng DNA/基因型）,然而对所有可疑SNP位点进行分析仍然需要大量的DNA样本。仅仅通过反应微型化技术似乎无法完成这样的任务,基因组DNA固定化以实现DNA的回收和反复利用是一比较理想的解决方法。为此,我们应用了DNA-水凝胶共聚化学,试图实现对基因组DNA的反复利用。首先,我们检测了DNA-水凝胶共聚化学的效率和热稳定性。随后,将这一策略成功地运用到质粒DNA以及人基因组DNA的固定和反复利用。1.DNA-水凝胶共聚化学的热稳定性研究根据pUCm-T-SEE的序列设计5’末端带有NH2的上下游引物T7和Puc26,以pUCm-T-SEE质粒为模板,进行PCR扩增,获得条带特异的PCR产物（NH2-T7-SEE-Puc26-NH2）,并纯化回收。稀释PCR产物到一定的浓度,在TEMED和AP的介导下,NH2-T7-SEE-Puc26-NH2的5’末端NH2与甲基丙烯酰胺发生共聚反应,固定到凝胶中。通过PCR反应检测凝胶中的模板DNA的固定状况。2.质粒DNA的固定研究提取pUCm-T-SEE质粒,在甲酸的作用下,部分嘌呤碱脱离产生活性醛基,活性醛基与乙二胺反应随机断裂质粒DNA,并在质粒碎片的3’末端引入活性NH2,便于固定反应。随后的固定以及热稳定性反应参见前述。3.人基因组DNA的固定研究提取人基因组,在甲酸的作用下,部分嘌呤碱脱离产生活性醛基,活性醛基与乙二胺反应随机断裂人基因组DNA,并在人基因组DNA碎片的3’末端引入活性NH2,便于基因组DNA的固定。随后的固定以及热稳定性反应参见前述。所有结果表明DNA-水凝胶共聚化学具有较好的热稳定性,并且特异性高,易于PCR反应的顺利进行。综上所述,我们认为DNA样本资源非常十分珍贵:特别有助于疾病影响因素的暴露,新生物标记物的发现,疾病危险性的预测以及疾病发生的预防和疾病治疗的合理指导。中国是一个人口大国,在基因组学研究方面,具有得天独厚的资源优势:中国的遗传资源丰富,少数民族相对隔离,遗传相对隔离,其基因组具有自身的特点;中国人口基数大,各种多基因病的发病人数也较多:在内地的边远地区人口流动性低,可以找到某个家系的全部或大部分成员,这些使得我们在基因分离研究中占有一定的优势。从现在起,我们就应该开始保存人类个体不同时期的基因组DNA,系统调查其生活环境、生活方式、饮食习惯以及健康/疾病状况,作为基本的研究资料,建立个人的基因组信息资料库。通过自身比对以及数据整合,寻找遗传易感基因和疾病靶基因,揭示疾病和基因、环境之间的联系,从而为日后疾病的快速诊断和及时的个性化治疗打下基础。在本次研究中,我们使用了水凝胶作为固相支持载体,选择了合适的化学固定方法,首次实现了对人基因组DNA的固定和反复使用。首先我们将末端修饰的PCR产物固定到凝胶上,检测了该法的固定效率以及热稳定性。通过改变反应条件,我们尝试用这一策略固定质粒碎片以及基因组DNA碎片,并作为模板DNA用于随后的PCR扩增反应中。该法固定DNA的效率高,热稳定性好,固定特异性高,同时固定载体具有良好的亲水性,便于随后的分子杂交以及PCR反应的进行。初步结论表明了这一方法的可行性,为将来的全基因组测序以及SNP检测打下了物质基础,并为系统的个体基因组自身比对分析提供了技术支持。
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