论文摘要
猪流感（Swine influenza,SI）是由A型流感病毒引起的一种猪的急性呼吸道传染病,一年四季均可发生,各种日龄的猪都可感染。目前对猪流感尚无有效的治疗手段,临床上主要通过疫苗接种预防该病。SI的商品化灭活疫苗主要是H1NI型和H3N2亚型单价或双价全病毒灭活疫苗。但由于近年来重组毒株频繁出现,以传统流行株为毒种的灭活疫苗已无法提供理想的保护作用,因此人们开始对SⅣ进行新型疫苗研究,以适应SIV高度变异的特性。猪流感病毒（swine influenza virus,SⅣ）是经上呼吸道粘膜进入机体引起感染的,因此黏膜免疫接种是预防SⅣ感染最佳免疫途径。大肠杆菌不耐热肠毒素（Heat-labile enterotoxin,LT）B亚基具有良好的黏膜佐剂功能。本研究利用计算模拟分析SⅣ主要保护性抗原蛋白血凝素（Heamagglutinin,HA）核苷酸序列,结合HA蛋白空间结构,筛选SⅣT、B抗原表位,并通过设计接头将表位片段串联,将该模拟表位串联于大肠杆菌热敏性肠毒素B亚基N端,并定向克隆到原核表达载体pET-30a（+）中,在融合基因下游设计了终止密码子,以及未有终止密码子两种形式,分别命名为pET-30a-EL1和pET-30a-EL2。经测序鉴定阅读框正确后,转化宿主菌BL21（DE3）中,以1mM IPTG诱导,目的片段获得成功表达。SDS-PAGE电泳,表达重组蛋白分别为33KD和38KD,与预期大小相相符。重组蛋白大量表达,经Ni2+亲和层析柱纯化后,得到单一的目的条带。免疫转印试验显示,重组蛋白可以与His-tag抗体发生免疫学反应,表明表达重组蛋白为构建的目的蛋白,蛋白命名EL1、EL2。经BCA蛋白定量试剂盒分析,蛋白浓度分别为1158.88μg/mL和1245.90μg/mL。纯化后的EL1、EL2蛋白分别采用肌肉、皮下和滴鼻方式免疫8周龄KM小鼠,间隔10-15天分别进行二免,三免。二、三免后,采血及鼻洗液,用间接ELISA检测血清及局部粘膜抗体、血凝抑制试验检测血清中抗猪流感病毒抗体、T淋巴细胞增殖检测小鼠外周血淋巴细胞增殖情况。通过ELISA方阵滴定试验确定最佳检测条件:血清抗体检测,EL1蛋白包被抗原浓度1:16（62.5ng/孔）,血清样品1:80稀释;EL2蛋白抗原最佳包被浓度1μg/孔,血清1:160稀释。鼻洗液样品检测,EL1抗原包被浓度15.6ng/孔,洗鼻液样品1:3稀释;EL2抗原包被浓度1μg/孔,洗鼻液样品1:3稀释。三免后,血清学检测结果:EL1肌肉免疫组、EL1皮下免疫组血清IgG达较高水平,滴度达到1:10000以上;而EL1滴鼻组血清抗体水平较低;肌肉、皮下组与滴鼻组/PBS对照组差异极显著（P＜0.01）,而EL1滴鼻组与PBs组无显著性差异（P＞0.05）。EL2各免疫组血清IgG抗体与PBS组差异均极显著（P＜0.01）。但不同免疫组之间差异也极显著（P＜0.01）。局部粘膜分泌型IgA抗体检测,EL1滴鼻组粘膜IgA抗体水平一直较低,与PBs组比较无显著性差异（P＞0.05）。但EL2滴鼻免疫组产生了较好的局部粘膜反应,IgA水平与PBS组差异显著（P＜0.01）。采用MTT法检测免疫小鼠外周血T淋巴细胞增殖情况,所有免疫组均检测到淋巴细胞增殖,与对照组相比,差异极显著（P＜0.01）;EL2不同处理组间也差异显著（P＜0.01）,EL2滴鼻组T细胞增殖最明显。HI试验检测猪流感病毒血凝抗体,肌肉、皮下处理组,抗SⅣH3N2亚型HI效价均达1:256以上,EL2滴鼻组的HI效价达1:32;但EL1蛋白滴鼻免疫组的HI效价较低,只有1:4,这与ELISA检测的结果相一致。上述结果表明,所构建的融合蛋白获得很好的表达,EL2重组蛋白无论以何种途径免疫小鼠,均产生较好的体液免疫反应和细胞免疫反应,其中滴鼻免疫还获得了理想的局部免疫分泌型IgA抗体,为阻止病毒由黏膜途径感染提供了有力的保护屏障,为SⅣ表位疫苗研制奠定了基础。
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