氧化葡萄糖杆菌催化仲醇拆分及其相关酶的研究

论文摘要

氧化葡萄糖酸杆菌因其不完全氧化糖、醇生成醛、酮、酸的能力,成为生物工业上应用广泛的微生物之一。以往所报道的氧化葡萄糖酸杆菌催化的底物基本属于多羟基的糖醇和伯醇,而作用于这些底物的膜结合脱氢酶也一直是研究的热点。基因组信息显示氧化葡萄糖酸杆菌含有众多的醛酮还原酶、短链醇脱氢酶、锌结合的脱氢酶等家族的氧化还原酶,但其中是否包含具有仲醇氧化活性的酶并不清楚,而利用氧化葡萄糖酸杆菌催化的动力学拆分反应合成手性仲醇的研究至今未见报道。本论文首次通过实验证明了氧化葡萄糖酸杆菌静息细胞可催化仲醇的动力学拆分获得单一构型的仲醇。通过调节反应体系中的关键参数——pH值,分别获得了不同构型的仲醇。实验选择了1-苯乙醇,1-苯基-2-丙醇和4-苯基-2-丁醇等三个模式底物,在酸性条件（pH5）下,静息细胞对于R构型仲醇的选择性要大于S构型,反应结束时主要残留S构型仲醇；碱性条件（pH8）下,底物的选择性相反,最终保留R构型的仲醇。通过条件优化,1-苯乙醇,1-苯基-2-丙醇,4-苯基-2-丁醇的e.e值分别可以达到90%（S）,100%（S）,100%（R）。在明确氧化葡萄糖酸杆菌静息细胞具有仲醇的选择性氧化特性的基础上,对其中催化该反应的酶进行了初步的鉴定。依据序列等信息,选取了两个可能属于短链醇脱氢酶家族、而功能未知的酶gox2036和gox0525作为研究对象,在E.coli BL21（DE3）中实现了可溶性表达,通过对重组蛋白的底物特异性测定,明确了Gox2036可以选择性地氧化消旋底物中的S构型的仲醇,保留R构型仲醇,为氧化葡糖酸杆菌在碱性条件下负责仲醇催化的主要酶。Gox0525不具备醇氧化活性,与氧化葡糖酸杆菌催化仲醇的反应无关,但它对α-酮羰基化合物、2-酮和酮酯具有较好的还原活性。除了对仲醇的氧化特性外,Gox2036还对脂肪酮、芳香酮、2,3-二酮、羟基酮和酮酯等化合物表现良好的还原特性,尤其是还原α-二酮生成重要的药物前体——手性的羟基酮。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 1.1 生物催化中氧化还原反应
• 1.1.1 微生物全细胞催化剂
• 1.1.2 氧化还原酶催化剂
• 1.2 氧化葡萄糖酸杆菌的特性
• 1.2.1 氧化葡萄糖酸杆菌的分类地位
• 1.2.2 氧化葡萄糖酸杆菌的基因组特征
• 1.2.3 氧化葡萄糖酸杆菌的基本代谢特点
• 1.3 氧化葡萄糖酸杆菌催化应用
• 1.3.1 葡萄糖酸氧化系统
• 1.3.2 山梨醇脱氢酶氧化系统
• 1.3.3 乙醇脱氢酶氧化系统
• 1.3.4 氧化葡萄糖酸杆菌中氧化还原酶的研究
• 1.4 生物法催化手性仲醇生成
• 1.5 本论文的研究意义及内容
• 第2章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种与质粒
• 2.1.2 仪器与设备
• 2.1.3 化学试剂
• 2.1.4 生物试剂
• 2.1.5 培养基配方
• 2.1.6 应用程序及软件
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 催化反应实验方法
• 2.2.2 生物信息学分析
• 2.2.3 基因的分子克隆
• 2.2.4 重组蛋白表达及纯化
• 2.2.5 酶学性质分析
• 2.2.6 光学选择性的确定
• 第3章 结果与分析
• 3.1 氧化葡萄糖酸杆菌手性拆分仲醇的研究
• 3.1.1 仲醇氧化拆分反应的初探
• 3.1.2 pH值对拆分效果的影响
• 3.1.3 温度对拆分效果的影响
• 3.1.4 菌体浓度对拆分效果的影响
• 3.1.5 助溶剂对拆分效果的影响
• 3.1.6 底物浓度对拆分效果的影响
• 3.2 氧化葡萄糖酸杆菌中催化仲醇氧化的酶的鉴定
• 3.2.1 仲醇氧化相关酶的定位
• 3.2.2 生物信息学预测
• 3.2.3 目的基因的分子克隆
• 3.2.4 重组蛋白在大肠杆菌中表达与纯化
• 3.2.5 酶学性质分析
• 3.2.6 Gox2036的光学选择性分析
• 第4章 结论与展望
• 4.1 结论
• 4.2 展望
• 参考文献
• 致谢