环酯肽抗生素吡啶霉素生物合成机制研究

论文摘要

吡啶霉素（pyridomycin）是由吡啶霉素链霉菌NRRL B-2517产生的具有抗结核分枝杆菌活性的环酯肽类抗生素。它的化学结构由N-3-羟基吡啶-L-苏氨酸,3-（3-吡啶）-L-丙氨酸,丙酸和可能由-酮基-β-甲基戊酸异构化形成的2-羟基-3-甲基-2-烯醇戊酸所构成。据我们所知,吡啶霉素是迄今为止报道的首例含有烯醇羧酸结构的环酯肽类天然产物。吡啶霉素特殊的化学结构中可能蕴藏着独特的生物合成机制,但其生物合成机理尚未有报道。本研究从遗传学和生物化学角度阐述吡啶霉素的生物合成机制,以期加深对这类天然产物生物合成途径的理解,同时为利用组合生物学手段对吡啶霉素产生菌进行分子水平改造从而获得更优活性的衍生物奠定理论基础。通过对吡啶霉素链霉菌的生长条件、产孢条件,和对接合转移培养基及接合转移条件进行优化,建立了吡啶霉素链霉菌的遗传操作系统。根据吡啶霉素的结构特征,利用NRPS腺苷化结构域、NRPS-PKS杂合体系的特征性KS结构域和3-羟基吡啶羧酸:AMP连接酶等简并引物从吡啶霉素链霉菌基因组文库中克隆到吡啶霉素生物合成基因簇,并得到体内中断实验证实。生物信息学分析显示测定的42.5 kb区域含有26个开放读码框（Open Reading Frame, ORF）,其中pyrA,pyrU,pyrE,pyrF,pyrG构成吡啶霉素的核心骨架结构。分析显示pyrE和pyrG是NRPS基因,pyrF是PKS基因。PyrA是一个与3-羟基吡啶羧酸:AMP连接酶同源的蛋白,PyrU是一个肽酰基载体蛋白（PCP）。体内基因中断和互补实验证实,pyrA和pyrU与吡啶霉素的生物直接相关。体外生化实验表明,PyrU执行PCP或者ArCP功能,PyrA能活化多种芳香羧酸和芳香氨基酸,显示出一定的底物宽泛性;此外,体外重构实验表明,PyrA可以活化多种芳香羧酸底物并加载到具有PCP功能的PyrU上。从而证明了PyrA和PyrU是构成吡啶霉素生物合成起始的NRPS模块,为起始结构类似的链阳菌素B类抗生素生物合成的起始机制研究提供了宝贵借鉴。PyrG是骨架结构中最后一个NRPS模块,其典型特征是含有两个A domain和一个嵌合在NRPS中的KR结构域。对A domain的活性氨基酸分析显示,两个A domain都不具备完整的活性中心,可能是以酶复合物的形式进行相应底物活化;而KR结构域含有典型的NAD（P）H结合的区域,同时含有其活性氨基酸Ser和Tyr,对这两个位点的体内定点突变实验表明KR结构域是有活性的,而且是必须的,可能参与烯醇羧酸结构的形成。PyrP-T这五个基因位于测序区域的末端,生物信息学分析显示可能参与吡啶环的生物合成。然而体内中断实验证明,这五个基因敲除后都不影响吡啶霉素的产生,负责吡啶霉素中这两个吡啶环生物合成的基因可能不存在于已测序区域,其具体生物合成机理还有待进一步研究。根据生物信息学分析、体内遗传学实验和体外生化实验证据,我们初步推断了吡啶霉素的整个生物合成途径。确证了负责核心骨架结构的基因,并推测初级代谢的部分基因参与两个吡啶环的生物合成,暗示该菌中存在着初级代谢与次级代谢间交叉对话。此外,在吡啶霉素产生菌的代谢产物中还发现了一个新的吡啶霉素结构类似物。说明其生物合成相关的酶具有一定的底物宽泛性,有利于产生吡啶霉素结构类似物。利用前体导向的生物合成技术,向野生型菌株中喂养不同的起始单元类似物前体,可以检测到起始单元3-HPA被替换的吡啶霉素结构类似物。因此,对吡啶霉素生物合成机制的研究,有利于综合运用组合生物合成等技术实现对吡啶霉素的结构改造和修饰,为药物活性筛选提供更多的吡啶霉素类似物奠定了理论基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明（Abbreviations）
• 第一章 文献综述
• 1.1 前言
• 1.2 天然产物的生物合成研究
• 1.3 聚酮和多肽类抗生素的生物合成研究
• 1.4 吡啶霉素生物合成研究进展
• 1.5 放线菌中铁载体生物合成机制研究进展
• 第二章 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 第三章 吡啶霉素产生菌Streptomyces pyridomyceticus NRRL B-2517 遗传操作系统的建立
• 3.1 前言
• 3.2 接合转移条件的摸索和建立
• 本章小结
• 第四章 吡啶霉素生物合成基因簇的克隆与鉴定
• 4.1 前言
• 4.2 吡啶霉素生物合成基因簇的克隆
• 4.3 吡啶霉素生物合成基因簇的鉴定
• 本章小结
• 第五章 吡啶霉素生物合成相关基因的序列测定与功能分析
• 5.1 吡啶霉素生物合成基因簇的序列测定
• 5.2 cosmid 9A3 中吡啶霉素生物合成相关基因的功能分析
• 本章小结
• 第六章 吡啶霉素生物合成起始模块功能的研究
• 6.1 前言
• 6.2 pyrA 基因功能的研究
• 6.3 pyrU 基因功能的研究
• 6.4 体外重构吡啶霉素生物合成的起始模块
• 本章小结
• 第七章 吡啶霉素生物合成基因pyrG 的功能研究
• 7.1 前言
• 7.2 PyrG 蛋白的生物信息学分析
• 7.3 体内遗传学实验探索KR 结构域的功能
• 本章小结
• 第八章 吡啶霉素中两个不同的吡啶环生物合成途径推测
• 8.1 前言
• T 的生物信息学分析推测吡啶环的生物合成途径'>8.2 根据pyrP^T的生物信息学分析推测吡啶环的生物合成途径
• T 基因的插入中断突变株'>8.3 构建pyrP^T基因的插入中断突变株
• 8.4 突变株的发酵检测
• 8.5 修正后的吡啶环生物合成途径推测
• 本章小结
• 第九章 吡啶霉素结构多样性研究和利用前体导向生物合成技术实现吡啶霉素的结构改造
• 9.1 前言
• 9.2 对野生型菌株进行吡啶霉素结构多样性检测
• 9.3 对野生型菌株进行非天然前体化合物喂养实验
• 本章小结
• 第十章 链霉菌中铁载体的生物合成研究
• 10.1 前言
• 10.2 获得克隆coelichelin 基因簇的探针
• 10.3 构建cchB 插入突变株TH2 和缺失整个cch 基因簇的突变株
• 10.4 测序cosmid 序列分析
• 10.5 cchlA 基因的定位和序列分析
• 10.6 基因中断实验证实亚热带链霉菌中存在铁载体desferrioxamines
• 10.7 RT-PCR 检测培养基中不同铁载体的转录
• 本章小结
• 第十一章 总结与展望
• 11.1 本研究工作总结
• 11.2 主要创新点
• 11.3 吡啶霉素生物合成研究进一步工作的展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表或已录用的学术论文