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半边莲生物碱和山梗菜碱对内皮素-1诱导的人脐动脉平滑肌细胞增殖作用的机制研究

2020-11-23阅读(240)

半边莲生物碱和山梗菜碱对内皮素-1诱导的人脐动脉平滑肌细胞增殖作用的机制研究

论文摘要

血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）增殖是动脉硬化（atherosclerosis，AS）、原发性高血压（primary hypertension，EH）、经皮冠状动脉腔内血管成形术后再狭窄的病理基础，因此探讨抑制VSMCs增殖的药物成为人们研究的热点。近来的研究表明，血管内皮细胞（vascular endothelial cells，VEC）释放的内皮素（endothelin，ET）具有强烈的缩血管作用。除了收缩血管作用外，ET还能够激活有丝分裂原活化的蛋白激酶，刺激c-fos和c-myc的表达而使VSMCs肥大和增殖。 ET是一族生物活性多肽，目前发现生物体内有4种形式的异型体，分别称为ET-1、ET-2和ET-3及血管活性肠收缩物质（Vasoactive intestinal contractor peptide，VIC），其中生物活性以ET-1最强。ET与自然界存在的某些生物毒素有一定亲缘关系，包括蛇毒、蝎毒和蜂毒等。Sarafotoxins（SRTX）是从蛇毒中提取的一种毒素，与ET具有共同的祖基因和相似的生物学活性，一级结构具有明显的同源性，至少有60％～80％氨基酸同源，而且有相同的C-末端。研究证实，ET的C-末端特别是Trp21，两个二硫键，氨基和羧基端，以及Asp8和Glu10的羧酸组对它的生物学活性起了重要的作用，构成了SRTX和ET表面的“共同和基本”的生物活性位点。SRTX和ET构成一组同源性异构肽家族，竞争性结合相同的G蛋白偶联受体，通过IP3、Ca2+、钙调蛋白激酶途径，引发各类生物学效应，因此可能从抗蛇毒中药中寻找防治动脉硬化、高血压等ET相关性疾病的药物。 民间早就流传抗蛇毒药徐长卿治疗高血压的偏方，1993年，张继峰等对抗蛇毒药物：徐长卿、半边莲和七叶一支花等做了初步的研究。通过离体血管条和整体动物实验发现半边莲和七叶一支花水提物可部分拮抗ET-1致小鼠的死亡作用，并可以抑制ET-1的缩血管和升压效应。王峰等对抗蛇

论文目录

  • 原创性声明
  • 关于学位论文使用授权的声明
  • 摘要
  • Abstract
  • 符号说明
  • 第一部分:建立内皮素-1诱导的人脐动脉平滑肌细胞增殖模型
  • 前言
  • 材料与方法
  • 1 实验材料
  • 1.1 主要试剂与配制
  • 1.2 主要仪器设备
  • 1.3 标本来源
  • 2 实验方法
  • 2.1 人脐动脉平滑肌细胞的原代培养和纯化
  • 2.2 平滑肌细胞鉴定
  • 2.3 不同剂量的ET-1对平滑肌细胞生长的影响
  • 2.4 建立ET-1诱导的人脐动脉平滑肌细胞细胞增殖模型
  • 3 统计学处理
  • 结果
  • 1.人脐动脉平滑肌细胞的倒置相差显微镜结果和鉴定
  • 2.不同剂量的ET-1对人脐动脉平滑肌细胞生长曲线的影响
  • 3.实验各组对人脐动脉平滑肌细胞细胞生长的影响
  • 讨论
  • 结论
  • 附图表
  • 参考文献
  • 第二部分: 半天莲生物碱和山梗菜碱对内皮素-1诱导的人脐动脉平滑肌细胞增殖的影响
  • 前言
  • 材料与方法
  • 1 实验材料
  • 1.1 实验原料与试剂
  • 1.2 主要试剂与配制
  • 1.3 主要仪器设备
  • 1.4 其他实验材料
  • 2 实验方法
  • 2.1 半边莲生物碱的制备
  • 2.1.1 半边莲提取
  • 2.1.2 半边莲生物碱分离
  • 2.1.3 半边莲生物碱纯化与鉴定
  • 2.2 细胞培养药液的配制
  • 2.2.1 半边莲生物碱溶液
  • 2.2.2 山梗菜碱溶液
  • 2.3 不同浓度DMSO的毒性对照实验
  • 2.4 半边莲生物碱和山梗菜碱的细胞毒性分析
  • 2.4.1 台盼兰染色排斥实验
  • 2.4.2 乳酸脱氢酶（LDH）检测
  • 2.5 细胞计数试剂盒筛选半边莲生物碱和山梗菜碱的剂量
  • 3HTdR掺入法反映VSMCs的DNA合成量'>2.63HTdR掺入法反映VSMCs的DNA合成量
  • 2.7 免疫细胞化学染色检测HUASMCs增殖细胞核抗原素（PCNA）的表 达水平
  • 3 统计学处理
  • 结果
  • 1 半边莲生物碱提取与分离
  • 2 不同浓度DMSO的细胞毒性实验
  • 3 半边莲生物碱和山梗菜碱的细胞毒性分析
  • 4 细胞计数试剂盒筛选半边莲生物碱和山梗菜碱的剂量
  • 3H-TdR掺入法反映HUASMCs的DNA合成量'>53H-TdR掺入法反映HUASMCs的DNA合成量
  • 6 免疫细胞化学染色检测HUASMCs增殖细胞核抗原素（PCNA）的表达 水平
  • 讨论
  • 结论
  • 附图表
  • 参考文献
  • 第三部分: 半边莲生物碱、山梗菜碱对内皮素-1诱导的人脐动脉平滑肌细胞的细胞周期进程的影响
  • 前言
  • 材料与方法
  • 1 实验材料
  • 1.1 主要试剂与配制
  • 1.2 实验仪器
  • 1.3 其余实验材科
  • 2 实验方法
  • 2.1 流式细胞仪检测细胞周期
  • 1mRNA和p21WAF1/CIP1 mRNA的表达'>2.2 RT-PCR方法测定HUASMCs中CyclinD1mRNA和p21WAF1/CIP1mRNA的表达
  • 3 统计学处理
  • 结果
  • 1. 实验各组药物对HUASMCs细胞周期的影响
  • 2. RNA鉴定
  • 1表达的影响'>3. 实验各组药物对HUASMCs中CyclinD1表达的影响
  • WAF1/CIP1表达的影响'>4. 实验各组药物对HUASMCS中p21WAF1/CIP1表达的影响
  • 讨论
  • 结论
  • 附图表
  • 参考文献
  • 第四部分:半边莲生物碱、山梗菜碱对内皮素-1诱导的人脐动脉平滑肌细胞增殖调节通路的影响
  • 前言
  • 材料与方法
  • 1 实验材料
  • 1.1 主要试剂与配制
  • 1.2 实验仪器
  • 1.3 其他实验材料
  • 2 实验方法
  • 2+浓度'>2.1 激光共聚焦显微镜检测细胞内游离Ca2+浓度
  • 2+浓度变化'>2.2 激光共聚焦显微镜动态观察细胞内Ca2+浓度变化
  • 2.3 RT-PCR方法测定HUASMCs中ETAR mRNA、PKCα mRNA的表达
  • 2 统计学处理
  • 结果
  • 1.实验各组药物对HUASMCs内钙荧光强度的影响
  • 2.实验各组药物对HUASMCs内钙荧光强度的动态变化
  • 3.实验各组药物对HUASMCs中ETAR mRNA表达的影响
  • 4.实验各组药物对HUASMCs中PKCα mRNA表达的影响
  • 讨论
  • 结论
  • 附图表
  • 参考文献
  • 总结
  • 一、主要研究结论
  • 二、主要创新点
  • 三、课题局限性与展望
  • 抗蛇毒中药防治高血压病的研究进展
  • 1 理论依据
  • 2 实验研究依据
  • 2.1 拮抗内皮素的升压作用
  • 2.2 拮抗内皮素受体
  • 2.3 保护血管内皮细胞
  • 2.4 抑制VSMC增殖功能
  • 参考文献
  • 致谢
  • 在读期间科研成果目录
  • 学位论文评阅及答辩情况表

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