双亲性分子伞的合成表征与穿膜研究

论文摘要

细胞膜作为细胞的一道天然屏障,使得许多具有治疗作用的药物和大分子生物活性物质,特别是高亲水性和带电物质,如反义寡聚核苷酸、DNA、蛋白质和多肽等难以通过细胞膜。构建一种药物载体使其能顺利穿透细胞膜并在靶向部位释放,已成为药物设计中亟需解决的问题之一。一种具有双亲性的分子伞载体有望携带上述药物实现跨膜运输,并解决许多载体在治疗过程中存在的穿膜效率低和安全性等问题。本论文的研究内容主要包括设计合成带有绿色荧光的5-羧基荧光素分子伞,考察其穿透细胞膜的能力和体外细胞毒性,探讨分子伞载体可能的穿膜机制。研究结果如下:（一）分子伞的合成与表征（1）在无水有机溶剂中,胆酸分子与N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）在缩合剂N,N′-二环己基碳二亚胺（DCC）的作用下反应得到胆酸-NHS活化酯,然后以二异丙基乙胺（DIPEA）为缚酸碱,在无水二甲基甲酰胺中胆酸-NHS活化酯与亚精胺的两个端氨基偶联,形成含有一个活性氨基（仲胺）的双臂分子伞,即N1,N3-亚精胺二胆酸酰胺。（2）在无水二甲基甲酰胺中,5-羧基荧光素与3-羟基-1,2,3-苯并三嗪-4（3H）-酮（Dhbt）在缩合剂N,N′-二环己基碳二亚胺（DCC）的作用下活化得到5-羧基荧光素的Dhbt活化酯,再以三乙胺为缚酸碱在无水二甲基甲酰胺中与上述双臂分子伞的活性氨基偶联,形成5-羧基荧光素分子伞（5-cf-mu）。（3）对各步产物如胆酸-NHS活化酯、N1,N3-亚精胺二胆酸酰胺和5-cf-mu的结构和分子量分别采用红外光谱法、核磁共振谱法和质谱法进行确定,同时对这三步产物的熔点进行测定;5-cf-mu的纯度采用高效液相色谱法进行分析。结果表明:这三步产物的各种表征结果与其相应分子结构、分子量都完全符合,5-cf-mu的纯度在95%以上。（二）分子伞的穿膜性能研究（1）MTT法检测了浓度分别为25,50,100和200μM的5-cf-mu在24和48h内对L929细胞的细胞毒性,结果表明:24 h内上述浓度的5-cf-mu对L929细胞均没有毒性;25μM的5-cf-mu在48 h内也没有毒性,50,100和200μM在48 h呈现少许毒性,但仍有较高的细胞成活率。同时检测了5-cf-mu对Hela细胞在24 h内的细胞毒性,结果表明浓度低于100μM时,分子伞对Hela细胞也没有毒性。上述结果说明分子伞具有良好的生物相容性。（2）采用荧光显微镜和激光共聚焦显微镜检测了5-cf-mu在Hela细胞和L929细胞内的分布情况。绿色荧光点不仅分布在细胞质中,而且分布在细胞核周围,表明5-cf-mu已经进入了Hela细胞和L929细胞。实验证明分子伞是一种可以实现跨膜运输的载体。（3）采用流式细胞仪考察了温度、浓度、时间以及ATP抑制剂作用下对5-cf-mu穿透细胞膜的效率的影响。结果表明分子伞的穿膜是一个时间、浓度和温度依赖而非能量依赖的过程。（三）分子伞的穿膜机制（1）建立了分子伞穿透细胞膜的数学模型。根据流式细胞仪检测结果,细胞内的平均荧光强度（MFI）与培养时间的平方根(t1/2)、初始浓度的平方根(Co1/2)均成很好的线性关系,线性相关系数（R值）分别为0.985和0.994。（2）分子伞穿透细胞膜的过程符合所建立的数学模型,表明分子伞是以溶解—扩散的方式穿透细胞膜。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 传统穿膜型载体的研究现状
• 1.1.1 腺病毒
• 1.1.2 脂质体
• 1.1.3 纳米粒
• 1.1.4 阳离子聚合物
• 1.1.5 分子偶联体
• 1.1.6 脂蛋白
• 1.1.7 聚合物胶束
• 1.2 穿膜肽载体的研究现状
• 1.2.1 穿膜肽的提出
• 1.2.2 穿膜肽的应用
• 1.2.3 穿膜肽的穿膜机制
• 1.2.4 穿膜肽的局限性
• 1.3 分子伞载体的提出与研究
• 1.3.1 分子伞的提出
• 1.3.2 分子伞的功能
• 1.3.3 分子伞穿透生物膜的机理
• 1.3.4 分子伞的应用
• 1.4 本课题的提出和研究内容
• 参考文献
• 第二章 分子伞的合成与表征
• 2.1 引言
• 2.2 材料和仪器
• 2.2.1 主要试剂
• 2.2.2 主要仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 反应溶剂的纯化
• 2.3.2 合成步骤
• 2.3.3 结构鉴定
• 2.3.4 纯度测定
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 胆酸-NHS活化酯
• 1,N₃-亚精胺二胆酸酰胺'>2.4.2 N₁,N₃-亚精胺二胆酸酰胺
• 2.4.3 5-羧基荧光素分子伞
• 2.5 本章小结
• 参考文献
• 第三章 分子伞的穿膜性能研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料和仪器
• 3.2.1 主要试剂
• 3.2.2 主要仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 溶液的配制
• 3.3.2 细胞的复苏
• 3.3.3 细胞培养
• 3.3.4 MTT法检测5-cf-mu的细胞毒性
• 3.3.5 倒置荧光显微镜检测5-cf-mu的内化
• 3.3.6 激光共聚焦扫描显微镜检测5-cf-mu的内化
• 3.3.7 流式细胞仪研究5-cf-mu穿膜的影响因素
• 3.4 结果和讨论
• 3.4.1 5-cf-mu的细胞毒性
• 3.4.2 分子伞的穿膜研究
• 3.4.3 分子伞穿膜的影响因素
• 3.4.4 分子伞的穿膜机理
• 3.5 本章小结
• 参考文献
• 第四章 全文结论及其展望
• 4.1 全文结论
• 4.2 展望
• 攻读硕士学位期间发表的论文
• 致谢