人NDRG1的原核表达、纯化及相互作用蛋白分析

论文摘要

人ndrg2 （N-myc downstream regulated gene 2） 基因是第四军医大学生化教研室【11,12】于1999 年从正常成人全脑cDNA 文库中最先发现并克隆得到的。其染色体定位于14q11.2,含有16 个外显子,15 个内含子;mRNA 全长为2,024 nt,编码含有357 个氨基酸残基,分子量约4.0×104的蛋白质。Ndrg 基因家族中最早被发现的是Ndrg1,它是在研究N-myc 下游调节基因时从小鼠胚胎中发现的一种新基因。目前已报道的该家族成员有4 个:ndrg1、ndrg2、ndrg3 和ndrg4,它们之间具有较高的同源性,但表达水平在组织发育阶段和分布上差异明显,具体功能还不清楚。NDRG 家族的表达受很多内外界因素的调节,使NDRG1 表达量提高的因素有homocystein、tunicamycin、细胞氧化应激（缺氧、Ni2+、各种还原试剂）、视黄酸、P53 等;使NDRG1 表达量降低的因素有:Androgen、c-myc、n-myc 等。综合已有文献,推测NDRG 家族可能参与细胞生长分化、维持细胞氧化还原电势平衡（氧化应激或生物转化）、阻止肿瘤细胞恶化等。因此,检测与其相互作用的蛋白,并由此研究其在细胞中的具体功能以及可能的信号通路将具有非常重要的意义。鉴于上述事实,本实验开展了以下几方面的研究: 1. ndrg 家族成员的表达载体构建:从已成功构建并测序的T 载体pMD18-T-ndrg1、pMD18-T-ndrg2、pMD18-T-ndrg4b 中酶切下ndrg1、ndrg2、ndrg4b 片段,克隆至pGEX-4T-1空载体中,构建成pGEX-4T-1-ndrg1、pGEX-4T-1-ndrg2、pGEX-4T-1-ndrg4b 表达载体。2. ndrg 家族成员的原核表达:分别用IPTG 诱导表达pGEX-4T-1-ndrg1、pGEX-4T -ndrg2、pGEX4T-1-ndrg4b,发现pGEX-4T-1-ndrg1 部分可溶,而pGEX-4T-ndrg2、pGEX4T-1-ndrg4b 均不溶。3. NDRG1 蛋白的纯化及western 验证:用谷胱甘肽琼脂糖珠-4B 珠亲和层析pGEX-4T-1-ndrg1 表达的融合蛋白GST-NDRG1,结果在Mr 6.6×104 处出现两条带,经western 验证发现它们均是GST-NDRG1。4. NDRG1 高表达细胞系的选育:选取三种肿瘤细胞系7721、A549、HHCC,培育后裂解细胞,western 验证,发现HHCC 表达的NDRG1 含量最高。5.NDRG1 相互作用蛋白的检测:将HHCC 细胞裂解液和纯化的GST-NDRG1 孵育,同时将GST-NDRG1 与Tris.CL 裂解液孵育作为对照,在同样条件下双向电泳,发现样品至少在Mr 4.3×104,pH6.0 左右处比对照多出一个点,此点可能就是与NDRG1 相互作用的蛋白。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一部分 文献综述
• 1. NDRG 家族的研究现状
• 1.1 NDRG 家族的发现
• 1.2 人 NDRG 家族成员及组织表达分布特点
• 1.3 NDRG 家族表达调节及功能的研究
• 2. 相互作用分子的检测方法
• 2.1 酵母双杂交
• 2.2 亲和层析
• 第二部分 实验部分
• 第一章 表达载体的构建
• 前言
• 1、材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2、结果
• 2.1 ndrg1、ndrg2、ndrg4b 的pGEX4T-1 的构建
• 2.2 TAP 载体的构建
• 3、讨论
• 第二章 人NDRG 家族成员的原核表达及NDRG1 的纯化
• 前言
• 1、材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2、结果
• 2.1 融合蛋白的表达时间优化
• 2.2 融合蛋白可溶性分析
• 2.3 GST-NDRG2 和 GST-NDRG4b 的变性与复性
• 2.4 GST-NDRG1 的亲和纯化
• 2.5 Western 分析
• 3、讨论
• 第三章 与NDRG1 相互作用的蛋白的检测
• 前言
• 1、材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2、结果
• 2.1 高含量 NDRG1 的细胞系 HHCC 的鉴定
• 2.2 孵育时间的确定
• 2.3 双向电泳确定未知蛋白
• 3、讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介