论文摘要
胶质母细胞瘤（WHO IV）是颅内最常见的高恶性肿瘤,侵袭能力强、易复发、患者预后极差。目前胶质母细胞瘤临床治疗方案主要采用手术治疗后给予肿瘤部位分割照射联合小剂量替莫畔胺（temozolomide, TMZ）治疗,放射治疗四周后按照标准方案服用六个周期的替莫哗胺（d1-ds/28d）,胶质母细胞瘤病人的预后得到改善,但平均生存时间仍仅有12-15个月。高脂溶性、小分子和易于透过血脑屏障的烷化剂,被国内外公认为治疗胶质瘤的标准化疗药物。替莫唑胺属于第二代烷化剂化疗药,是咪唑四嗪类衍生物,不经肝脏代谢,可直接在脑胶质瘤组织碱性环境中分解,生成活性物质MTIC （3-methyl-triazen 1-yl） imidazole-4-carboxomide, MTIC),其疗效佳、副作用小的特点备受临床青睐。然而,肿瘤细胞固有的或获得性的耐药部分地限制了替莫唑胺的临床治疗效果。肿瘤细胞对化疗药物的耐药性是导致治疗失败的主要原因之一,肿瘤细胞耐药涉及因素很多,其中O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase? MGMT）是烷化剂主要的耐药基因。MGMT是一种DNA修复酶,其可在不需任何辅助因子或其他蛋白质的条件下催化DNA分子中鸟嘌呤O6位上的烷基转移至MGMT本身第145位的半胱氨酸残基上,使鸟嘌呤复原,DNA的结构和功能得以恢复,从而保护细胞免受烷化剂的损伤。肿瘤放射治疗的机制,主要是通过放射线产生的自由基和损伤DNA来诱导肿瘤细胞凋亡,其有效性已经由多项肿瘤细胞放射线照射治疗研究所证实。有研究发现联合放、化疗不仅可以利用替莫唑胺代谢产物所产生的细胞毒性和放疗本身对细胞的杀伤作用,还可利用替莫唑胺对放疗的增敏作用,利用两种疗法的协同效应,可减少替莫唑胺的使用剂量,增强治疗的疗效。恶性胶质瘤患者常常伴有严重的瘤周水肿、术后反应性水肿及放疗后脑水肿。糖皮质激素如甲强龙（methylprednisolone, MP）是治疗脑水肿非常有效的一类药物。但是,最近的一些研究证实,糖皮质激素对放疗或化疗诱导的细胞死亡起反作用。我们在前期研究中发现,当把甲强龙单独加入到体外培养的恶性胶质瘤细胞,对细胞生长几乎无影响；当对肿瘤细胞进行放疗或替莫唑胺化疗时应用甲强龙,与单独放疗或化疗相比,肿瘤细胞生长抑制明显减弱。因此,本研究试图弄清甲强龙是否抵抗放化疗的治疗效果,及其诱导肿瘤细胞产生化疗耐药及放疗抵抗的机制。目前尚无甲强龙对替莫唑胺化疗及放射治疗作用影响的研究报道。本课题研究分为以下二个部分：第一部分探讨甲强龙在入胶质母细胞瘤替莫唑胺化疗治疗过程中对MGMT表达的影响。通过磺酰罗丹明B （Sulforhodamine B, SRB）法检测细胞存活率,Western Blot及RT-PCR检测MGMT在胶质瘤细胞中的表达情况,加药处理后,与对照组相比,替莫唑胺组及替莫唑胺+甲强龙组U251细胞的生长在处理24小时后出现明显抑制（P<0.05）,随时间推移,在替莫哗胺处理组细胞增殖抑制程度逐步下降,在96h及120h抑制程度下降最明显,而替莫唑胺+甲强龙组细胞在48h后即出现受抑制程度下降的表现（P＜0.05）。MGMT在第24h甲强龙组表达水平明显高于其他各组（P<0.05）,替莫唑胺+甲强龙组低于甲强龙组但高于对照组及替莫唑胺组（P<0.05）,在第120h替莫唑胺+甲强龙组MGMT表达水平最高（P<0.05）。替莫唑胺组MGMT随着时间的延长,表达水平先降低后增高（P>0.05）,在第120h最高（P<0.05）,停药72h后MGMT表达水平下降（P<0.05）,替莫哗胺+甲强龙组MGMT具有同样的趋势但表达水平较替莫唑胺组高（P<0.05）。第二部分探讨替莫唑胺及甲强龙对人胶质瘤细胞放疗敏感性的影响。通过SRB法检测放疗后细胞存活率,经流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡变化情况。用Western blot方法检测凋亡相关基因Bax及Bc1-2蛋白表达的变化。U251细胞在处理后,放疗+甲强龙组细胞存活率明显高于其他实验组（P<0.05）,在24h及48h放疗+替莫唑胺+甲强龙组细胞增殖率高于放疗+替莫唑胺组（P<0.05）,但在72h及96h两组之间细胞增殖率差异不明显（P>0.05）。细胞凋亡检测显示,除对照组外各实验组凋亡率均明显升高（P<0.01）。在凋亡率增加的各组中,放疗+甲强龙组的凋亡率最低（P<0.05）,其余三组间凋亡率无明显差异（P>0.05）。Bax蛋白在放疗+替莫唑胺组与放疗+替莫唑胺+甲强龙组较对照组、放疗组、放疗+甲强龙组表达水平明显增高（P＜0.05）。Bcl-2蛋白在放疗+甲强龙组与放疗+T+甲强龙组较对照组、放疗组、放疗+替莫唑胺组表达水平明显增高（P<0.05）。Bax/Bcl-2表达比值在放疗+替莫唑胺组最高,放疗+甲强龙组最低（P<0.05）,其余三组间基本相同。结论：1.甲强龙能增强MGMT表达,当替莫唑胺与甲强龙联合作用于胶质瘤细胞时,细胞不仅表达更多的MGMT并显示出对替莫唑胺细胞毒作用更强的抵抗作用,而且随着时间的延长,MGMT表达水平逐渐增高,停药后下降2.甲强龙可以诱导人胶质瘤细胞产生放疗抵抗。替莫唑胺对甲强龙诱导的放疗抵抗有增敏作用。恶性胶质瘤患者应用甲强龙减轻放疗副作用过程中所诱导的放疗抵抗可以通过同时应用替莫唑胺予以抵消。