人工栽培黄花蒿青蒿素含量的株间差异及遗传多态性分析

论文摘要

黄花蒿（Artemisia annua L.）是我国的传统中药,其主要有效成分青蒿素已作为抗疟疾特效药得到广泛应用。同时,青蒿素对治疗肿瘤、寄生虫、艾滋病并发症等的良好效果也受到广泛关注。从黄花蒿中提取天然青蒿素是目前获取青蒿素的唯一来源。然而,黄花蒿栽培群体的株间差异大,青蒿素含量差异十分悬殊,导致群体的青蒿素整体含量低。发展适合分子遗传研究需要的青蒿素含量检测方法,加强黄花蒿青蒿素含量的分子遗传研究,促进青蒿素高含量黄花蒿新品种的培育与应用,必将大大提高经济效益和耕地利用效率。本课题首先优化了针对单株含量检测的青蒿素测定方法,实现了对青蒿素含量的快速、简便、准确测定;同时,分析了对黄花蒿栽培群体的遗传多态性及其与青蒿素含量差异的关系。此外,就人工诱变对青蒿素含量和遗传多态性的影响进行了初步研究。主要研究结果如下:1青蒿素含量的优化测定方法:黄花蒿干叶粉1g,石油醚（60～90℃）10mL, 50℃超声波提取5min,共提取3次,合并浸提液。50℃减压浓缩成浸膏,用95%乙醇定容至50ml。吸取溶液10ml,再用0.2% NaOH溶液定容到50ml。50℃水浴30min,冷却至室温,用紫外-可见分光光度计测292nm吸收峰值。2对黄花蒿干叶粉1g小样中青蒿素含量的检测,样品的充分研磨至关重要,否则将严重影响检测结果的准确性。3按照优化方法测定的结果显示,四川青川地区人工种植的黄花蒿群体,平均含量为9.34‰,但是株间差异达1倍以上。说明通过品种选育程序提高黄花蒿群体的整体青蒿素含量具有很大潜力。4用改良的CTAB法提取黄花蒿干叶DNA,效果良好,可以满足黄花蒿分子标记、多态性分析等研究中PCR反应对模板DNA的质量要求,这不仅能极大方便从野外远距离获取黄花蒿样本,还为PCR技术在黄花蒿生药材和原料真伪鉴定等领域的应用奠定了基础。5提出了逆境响应元件锚定的AFLP（Stress-response-elements Restricted AFLP, SR-AFLP）扩增方法,证明了这一多态性分析新方法的有效性,开辟了利用启动子区逆境响应元件的序列特征,将PCR多态性分析技术用于发现中草药有效成分含量相关基因的有效途径。6利用SR-AFLP扩增方法发现了2个与青蒿素含量相关的位点。为进一步深入研究决定青蒿素含量的分子机制和相关基因奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• 英文摘要
• 第一部分 文献综述
• 1 黄花蒿的生物学特性与青蒿素含量
• 1.1 黄花蒿的生物学特性
• 1.2 黄花蒿的遗传多样性与青蒿素含量
• 2 青蒿素的理化性质
• 2.1 分子结构
• 2.2 青蒿素理化性质
• 2.2.1 过氧基团反应
• 2.2.2 显色反应
• 2.2.3 酸碱反应
• 3 青蒿素的检测方法
• 3.1 定性分析
• 3.2 定量分析
• 3.2.1 含量较高的定量分析
• 3.2.2 含量较低的定量分析
• 4 青蒿素的生物合成途径研究
• 4.1 青蒿素的生物学合成途径
• 4.2 青蒿素生物合成途径中的已知关键酶
• 4.3 逆境对青蒿素合成的影响
• 5 青蒿素及其衍生物的药理作用研究
• 5.1 最早发现并正在广泛加以应用的抗疟疾作用
• 5.2 具有重大开发应用前景的抗肿瘤作用
• 5.3 已经受到广泛关注的治疗寄生虫病
• 5.4 其它重要作用
• 6. 植物的人工诱变技术及其应用
• 6.1 人工诱变的种类
• 6.2 各种诱变方法的比较与诱变剂的选择
• 6.3 EMS 作用机制
• 6.4 EMS 诱变的特点
• 6.5 人工诱变育种技术的成功应用与展望
• 7 DNA 多态性分析及技术进展
• 7.1 DNA 多态性分析的意义
• 7.2 常用的DNA 多态性分子标记
• 7.2.1 RFLP 标记
• 7.2.2 RAPD 标记
• 7.2.3 SSR 标记
• 7.2.4 STS 标记
• 7.2.5 SCAR 标记
• 7.2.6 AFLP 标记
• 7.3 针对 AFLP 标记方法局限性的技术改进
• 7.3.1 Sau-PCR
• 7.3.2 TE-AFLP
• 7.3.3 PstI-AFLP
• 8 本课题的研究目的与意义
• 第二部分 研究内容与实验方案
• 第一章 黄花蒿的材料培植及诱变
• 1 播种育苗
• 2 幼苗移栽
• 3 田间管理
• 4 样品采集与处理
• 5 对黄花蒿种子的诱变处理
• 5.1 诱变材料
• 5.2 诱变剂
• 5.3 处理方法
• 5.4 处理结果
• 第二章 黄花蒿单株小样的青蒿素含量检测
• 1 材料、设备
• 1.1 实验材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 仪器设备
• 2 实验方法
• 2.1 青蒿素含量标准曲线的制备
• 2.2 仅用 1g 黄花蒿干叶的小样分析条件优化
• 2.2.1 提取工艺
• 2.2.2 样液的处理
• 2.2.3 样品溶液的测定
• 2.3 不同制样方法的对比实验
• 3 优化工艺可靠性实验
• 3.1 仪器精准度测验
• 3.2 稳定性试验
• 3.3 重现性试验
• 4 实验结果
• 4.1 不同制样方法对青蒿素含量测量影响
• 4.2 黄花蒿干叶中青蒿素含量测定的优化方法
• 4.3 黄花蒿单株小量样品的青蒿素含量测定
• 5 讨论
• 第三章 黄花蒿干样与鲜样的DNA 提取方法比较
• 1 材料、设备及分析方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 仪器设备
• 2 实验方法
• 2.1 黄花蒿基因组 DNA 的提取
• 2.1.1 干样的SDS 提取法
• 2.1.2 改良的CTAB 提取法
• 2.2 琼脂糖胶电泳检测
• 3 结果与分析
• 3.1 不同 DNA 提取方法的结果比较
• 4 讨论
• 第四章 黄花蒿单株含量多态性的PCR 扩增
• 1 实验材料、设备
• 1.1 实验材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 仪器设备
• 2 已知关键酶基因的PCR 引物设计与扩增
• 2.1 引物设计
• 2.1.1 倍半萜环化酶的引物设计
• 2.1.2 二烯合酶的引物设计
• 2.1.3 鲨烯合酶的引物设计
• 2.1.4 8-epi-柏木脑醇合酶的引物设计
• 2.2 扩增反应体系与程序
• 2.2.1 扩增反应的体系
• 2.2.2 扩增反应的程序
• 2.3 PCR 产物的酶切与浓缩
• 2.3.1 PCR 产物的酶切
• 2.3.2 酶切产物的浓缩
• 2.4 琼脂糖凝胶电泳
• 3 逆境响应元件锚定的AFLP 扩增方法
• 3.1 接头与引物的设计
• 3.1.1 AFLP 接头的设计
• 3.1.2 AFLP 选择性引物的设计
• 3.1.3 逆境响应元件引物的设计
• 3.2 扩增方案
• 3.3 扩增方案可行性的实验验证与条件优化
• 3.3.1 DNA 模板的酶切体系
• 3.3.2 AFLP 接头的退火
• 3.3.3 接头的连接
• 3.3.4 LPA 与 CPA 短引物的分步预扩增
• 3.3.5 SPA－1 选择性扩增可行性验证
• 3.3.6 SPA－2 的选择性扩增可行性验证
• 3.4 黄花蒿群体单株的 AFLP 扩增
• 3.5 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳
• 4 结果与分析
• 4.1 关键酶基因的 PCR 结果
• 4.2 PCR 产物的酶切结果
• 4.3 AFLP 扩增方案的可行性的实验验证结果
• 4.3.1 DNA 模板的酶切体系可行性验证结果
• 4.3.2 +1 碱基的选择性扩增可行性验证结果
• 4.3.3 +3 碱基的选择性扩增引物可行性验证
• 4.4 黄花蒿群体单株的 AFLP 扩增结果
• 5 讨论
• 第三部分 课题总结
• 1 黄花蒿单株小样的青蒿素含量检测
• 2 黄花蒿不同青蒿素含量的遗传多态性分析
• 参考文献
• 致谢
• 附图