棉花黄萎病拮抗内生细菌的筛选鉴定及其抗菌物质研究

论文摘要

棉花黄萎病是由大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）引起的世界范围内的流行病害,对棉花的品质及棉农经济造成了严重的影响。长期使用化学农药进行防治,对生态环境造成破坏,使病原菌产生抗药性,限制了棉花产业的可持续发展,生物防治是解决这一问题的有效途径。植物内生细菌存在于植物体内,容易占据有利的生防位置,能够耐受植物自身防卫反应,可以和病菌直接作用,提供给植物全面有效的保护,具有良好的生防应用前景。本研究旨在从棉株中筛选对棉花黄萎病菌有较强抑菌效果的拮抗内生菌,优化拮抗菌株发酵条件,对拮抗菌分泌的抗菌物质进行分离纯化及性质研究,并对其抑菌机理进行初步研究。主要内容如下:采用稀释涂布法从河北辛集、博野等地的棉株中共分离到120株内生细菌,通过平板对峙法初筛获得36株对棉花黄萎病菌有拮抗作用的细菌,通过平板扩散-定殖能力法双重复筛选出2株有较强拮抗活性的菌株。结合形态特征、生理生化特性以及16S rDNA基因序列分析,将两株菌鉴定为枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌,并分别命名为BSD-2和BPT-18。两株菌都有较高的遗传稳定性,对抑菌谱的测定表明菌株BSD-2的抑菌谱较广。菌株BSD-2产抗菌物质发酵条件的研究结果表明,液体发酵的最适培养基为:牛肉膏0.5%,蛋白胨1%,NaCl 0.5%,葡萄糖2%;最佳培养条件为:初始pH 7.0-7.5,装液量为50 mL/250 mL,接种量为5%,30℃,200 r/min震荡培养38 h。发酵液经40%饱和度硫酸铵沉淀后经Sephadex G-75柱层析,Sephadex G-50柱层析,分离纯化出一种对棉花黄萎病菌有抑制作用的抗菌物质A。经高效液相色谱检测,活性组分已基本得到纯化。该抗菌物质耐高温;对酸碱稳定;对胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K不敏感;对氯仿不敏感;耐紫外线照射;在220 nm和280 nm处有紫外吸收峰;茚三酮和双缩脲反应均为阳性,初步判定该物质为抗菌多肽。抑菌机理的研究表明,BSD-2菌株分泌纤维素酶和蛋白酶,纤维素酶和蛋白酶能降解真菌细胞壁的纤维素和蛋白质组分,从而使真菌菌丝受到破坏,抑制其生长;该菌株发酵液能够有效抑制黄萎病菌菌丝生长和孢子萌发;其挥发性代谢产物对菌丝生长也有抑制作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 文献综述
• 1.1 棉花黄萎病研究进展
• 1.1.1 棉花黄萎病病原菌及生理型
• 1.1.2 棉花黄萎病的分布与危害
• 1.1.3 棉花黄萎病的防治现状
• 1.1.4 棉花黄萎病的生物防治研究进展
• 1.2 植物内生细菌研究动态
• 1.2.1 内生细菌的分离
• 1.2.2 内生细菌在植物病害生物防治中的应用
• 1.2.3 内生细菌作为生防因子的作用机制
• 1.2.4 植物内生细菌研究展望
• 1.3 植物内生枯草芽孢杆菌研究现状
• 2 棉花黄萎病拮抗内生细菌的筛选鉴定
• 2.1 材料
• 2.1.1 样品
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 菌种
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 拮抗内生细菌的分离筛选
• 2.2.2 菌株遗传稳定性研究
• 2.2.3 拮抗菌株发酵液抑菌谱的检测
• 2.2.4 菌株鉴定
• 2.2.5 数据记录及处理
• 2.3 结果
• 2.3.1 拮抗内生细菌的分离筛选
• 2.3.2 菌株的遗传稳定性
• 2.3.3 菌株D-2 和菌株T-18 发酵液抑菌谱
• 2.3.4 菌株鉴定
• 2.4 小结
• 3 菌株BSD-2 产抗菌物质发酵条件的研究
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 培养基
• 3.2 方法
• 3.2.1 培养方法
• 3.2.2 发酵滤液抗菌活性测定
• 3.2.3 菌株BSD-2 生长曲线的测定
• 3.2.4 培养基对菌株BSD-2 产抗菌物质的影响
• 3.2.5 发酵条件对菌株BSD-2 产抗菌物质的影响
• 3.3 结果
• 3.3.1 菌株BSD-2 生长曲线
• 3.3.2 不同培养基对抗菌物质产生的影响
• 3.3.3 发酵条件对菌株BSD-2 产抗菌物质的影响
• 3.4 小结
• 4 抗菌物质的分离纯化及性质研究
• 4.1 材料
• 4.1.1 实验菌株
• 4.1.2 试剂
• 4.1.3 仪器
• 4.2 方法
• 4.2.1 发酵液制备
• 4.2.2 抗菌活性的测定
• 4.2.3 硫酸铵沉淀法分离抗菌物质
• 4.2.4 超声波破碎法制备胞内提取物
• 4.2.5 BSD-2 菌株抗菌物质的分离纯化
• 4.2.6 抗菌物质性质的研究
• 4.3 结果
• 4.3.1 硫酸铵沉淀法分离抗菌物质
• 4.3.2 胞内提取液的拮抗活性测定
• 4.3.3 Sephadex G-75 柱层析分离结果
• 4.3.4 Sephadex G-50 柱层析分离结果
• 4.3.5 蛋白质/肽电泳结果
• 4.3.6 高效液相色谱（HPLC）分析结果
• 4.3.7 菌株BSD-2 抗菌物质性质研究
• 4.4 小结
• 5 枯草芽孢杆菌BSD-2 拮抗机理研究
• 5.1 材料
• 5.1.1 供试菌
• 5.1.2 培养基
• 5.2 方法
• 5.2.1 BSD-2 产几丁质酶能力的测定
• 5.2.2 BSD-2 产纤维素酶能力的测定
• 5.2.3 BSD-2 产蛋白酶能力的测定
• 5.2.4 BSD-2 产β-1，3 葡聚糖酶能力的测定
• 5.2.5 对黄萎病原菌菌丝生长的影响
• 5.2.6 对黄萎病菌孢子萌发的影响
• 5.2.7 挥发性代谢产物对黄萎病菌的拮抗作用
• 5.2.8 数据记录与分析
• 5.3 结果
• 5.3.1 BSD-2 产几丁质酶、纤维素酶、蛋白酶、β-1，3 葡聚糖酶能力的测定
• 5.3.2 对黄萎病病原菌菌丝生长的影响
• 5.3.3 对黄萎病菌孢子萌发的影响
• 5.3.4 挥发性代谢产物对黄萎病菌的拮抗作用
• 5.4 小结
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 后记（含致谢）
• 攻读学位期间取得的科研成果清单