论文摘要
人类转录因子T-bet（T-box expressed in T cells，T-bet）基因，作为Th1细胞特异性的转录因子，在Th1细胞分化中诱导IFN-γ分泌，上调IL-12Rβ2的表达，同时抑制IL-4的表达。此基因的开放阅读框架包含1607bp，可编码530个氨基酸残基，其中有一个由189个氨基酸组成的能与T盒DNA结合的结构域，主要在肺、脾脏及胸腺表达，其分布说明T-bet的表达具有限制性。目的克隆并鉴定人T-bet基因；构建原核表达载体并在体外表达T-bet蛋白，纯化蛋白作为抗原免疫小鼠，制备并初步鉴定单克隆抗体；构建携带穿膜序列（Tat）和目的基因（T-bet）的表达载体，通过大肠埃希菌表达TAT-T-bet蛋白，将此重组蛋白转染THP-1细胞，初步观察T-bet在调节Th1／Th2平衡中的作用。方法（1）从人外周血分离单个核细胞，抽提总RNA，逆转录cDNA，PCR扩增获得人T-bet基因；将T-bet基因克隆至pGEM-T载体，进行单、双酶切鉴定及序列分析。（2）将T-bet基因克隆到pQE30原核表达载体，在大肠杆菌M15中表达，获得带有His标签的62KD左右的T-bet融合蛋白；利用Bio-Rad公司的IMAC柱纯化T-bet蛋白；以T-bet蛋白作为抗原免疫Balb／c小鼠，取免疫小鼠的脾细胞与SP2／0细胞融合，在HAT培养基中培养并筛选得到分泌抗T-bet单克隆抗体的杂交瘤细胞株。（3）T-bet基因克隆到pIRES2-eGFP真核表达载体，将重组质粒pT-bet通过电穿孔法导入人单核巨噬细胞株THP-1，并以空质粒电转THP-1细胞作为阴性对照；用G418筛选电转阳性细胞，得到单个克隆阳性细胞株。（4）将穿膜序列TAT重组到pQE30载体上，构建具有穿膜功能的原核表达载体；再将T-bet基因重组到pQE30-TAT载体上，在大肠埃希菌M15中表达具有穿膜功能的T-bet蛋白；将纯化的穿膜蛋白加入THP-1细胞培养体系，观察穿膜现象及效率；将蛋白转染的THP-1细胞与外周血CD4+T细胞共培养，初步观察TAT-T-bet对THP-1细胞的作用，探讨转染的THP-1细胞对CD4+T细胞分化的影响。结果（1）成功克隆了包括1607bp编码区的人T-bet基因全长，并在大肠埃希菌有效表达，获得了纯化的T-bet蛋白。（2）成功制备了人T-bet单克隆抗体，经三个月克隆和筛选，获得三株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，经ELISA和Western-blot鉴定具有良好的反应性及特异性。（3）构建具有穿膜功能的pQE30原核表达载体，获得T-bet穿膜蛋白，并以浓度和时间依赖的方式转染THP-1细胞，转染的THP-1细胞与CD4+T细胞共培养，能诱导CD4+T细胞分泌IFN-γ，促进Th1细胞的分化。结论获得了人T-bet克隆并在大肠埃希菌中有效表达。制备和纯化了人T-bet蛋白，并以此为抗原，应用杂交瘤技术制备了分泌T-bet抗体的杂交瘤细胞株。应用蛋白转染技术，成功将重组人T-bet蛋白转染THP-1细胞株，籍此考察和分析了转有T-bet蛋白的THP-1细胞对Th1细胞的调节作用，且表明T-bet蛋白转染的THP-1可通过上调IFN-γ的表达而促进Th1活性。