配体—量子点定位肾上腺素受体以及在药物筛选中的应用

论文摘要

本文第一章首先阐述了药物筛选的几种主要方法,包括高特异性筛选,高通量筛选,高内涵筛选等。药物筛选是新药研究的最初过程和关键步骤。其次介绍了实验中所研究的肾上腺素受体（AR）,并对所用的去氧肾上腺素（PE）和哌唑嗪（Prazosin）进行了详细的介绍。随后对荧光染料进行了综述,重点介绍了我们在实验中用到的半导体荧光染料——量子点（QD）,由于其具有许多独特的优点,使其在药物筛选方面的应用取得很大进展。最后对基于荧光的药物筛选进行了展望。本文第二章是用QD标记的Prazosin定位α1A-AR。我们首次用QD标记的Prazosin结合TIRFM定位了HEK293细胞膜上的α1A-AR。实验中以我们对Prazosin-biotin与QD-streptavidin的结合比例,Prazosin-biotin与QD-streptavidin的浓度,孵育时间等多种影响受体标记的因素进行了研究,确定了定位HEK293细胞膜上的α1A=AR的最佳条件,并且通过一系列的实验证明了QD-streptavidin与Prazosin-biotin以及Prazosin-QD与α1A=AR结合的特异性。在实验过程中,我们观测到溶液中的Prazosin-QD被细胞膜上的α1A-AR捕获,QD荧光清楚的显示了细胞膜上的α1A=AR,这就为QD用于药物筛选打下了基础。本文第三章是QD标记的PE来定位α1A-AR。我们研究了PE与生物素之间连接不同链长的化合物时,PE与细胞表面α1A-AR结合的情况,发现在生物素与PE之间的链越长,越易于与细胞表面α1A-AR结合,反映了QD对于细胞表面受体-配体的结合存在空间位阻的影响。因此,我们选择链最长的PE（D）作为定位α1A-AR的激动剂,并且用几种方法证明了PE与α1A-AR结合的特异性。我们观测了激动剂PE和拮抗剂Prazosin与α1A-AR结合作用的差异,发现PE（D）-QD作用于受体后,荧光点分布在整个细胞中,而Prazosin-QD作用于受体后,荧光点只存在于细胞表面上。最后,我们用PE（D）-QD孵育细胞,采用TIRFM在不同时间点观测了HEK293细胞α1A-AR的内吞及生成的内涵体,表明我们用QD标记的PE仍具有药理活性。通过上述研究,我们可以根据QD荧光标记的激动剂和拮抗剂作用于受体之后,所引发的生物学效应的不同,在药物筛选中进行激动剂和拮抗剂的区分。本文第四章是我们首次采用QD标记拮抗剂的方法来进行药物筛选。首先用Prazosin-QD来标记HEK293细胞上的α1A-AR,然后用待筛选的药物作用于HEK293细胞,观察细胞表面的荧光点分布变化。通过比较待筛选药物作用于细胞之后细胞表面荧光点减少的程度,来相对比较待筛选药物与α1A-AR的亲和力大小。实验结果表明,五种待筛选的拮抗剂与α1A-AR的亲和力的活性顺序是Urapidil＞Terazosin＞Doxazosin＞Phentolamine＞Prazosin＞Tamsulosin,这个药物亲和性顺序与经典的放射性配体结合实验方法得到的结果基本相同,说明该方法可用来研究药物与受体之间的相互作用,进行受体亚型选择性药物的筛选。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 第一章 量子点在药物筛选中的应用
• 1.1 引言
• 1.2 药物筛选技术
• 1.2.1 高特异性药物筛选
• 1.2.2 高通量药物筛选
• 1.2.3 高内涵药物筛选
• 1.2.4 生物芯片药物筛选技术
• 1.2.5 邻近闪烁分析技术
• 1.2.6 褶合光谱法
• 1.2.7 计算机模拟药物筛选技术
• 1.3 肾上腺素受体的结构及功能
• 1.3.1 AR的分类
• 1.3.2 AR各个亚型的分布和功能
• 1.3.3 AR的内吞
• 1.4 肾上腺素受体激动剂和拮抗剂
• 1.4.1 肾上腺素受体激动剂
• 1.4.2 肾上腺素受体拮抗剂
• 1.5 量子点在药学研究中的应用
• 1.5.1 量子点的光学特征
• 1.5.2 量子点在生物学中的应用
• 1.5.3 量子点在药物筛选中的应用
• 1.5.3.1 量子点在药物靶点研究中的应用
• 1.5.3.2 量子点在药物传递研究中的应用
• 1.5.3.3 量子点在高通量筛选中的应用
• 1.6 展望
• 1.7 参考文献
• 1A-肾上腺素受体'>第二章 拮抗剂-量子点定位α_1A-肾上腺素受体
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 试剂
• 2.2.2 细胞培养及处理
• 2.2.3 仪器
• 1A-AR荧光图像的获取方法'>2.2.4 活细胞上α_1A-AR荧光图像的获取方法
• 1A-AR比例的选择'>2.2.5 QD定位HEK293细胞α_1A-AR比例的选择
• 1A-AR浓度的选择'>2.2.6 QD定位HEK293细胞α_1A-AR浓度的选择
• 1A-AR时间的选择'>2.2.7 QD定位HEK293细胞α_1A-AR时间的选择
• 2.2.8 特异性结合实验
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 细胞自发荧光的消除
• 2.3.2 采用TIRFM对活细胞下表面的受体进行成像
• 2.3.3 Prazosin的QD荧光标记
• 2.3.4 Prazosin-biotin与QD-streptavidin比例的选择
• 2.3.5 Prazosin-biotin与QD-streptavidin浓度的选择
• 2.3.6 孵育时间的选择
• 1A-AR的特异性'>2.3.7 生物素化的哌唑嗪定位α_1A-AR的特异性
• 2.4 结论
• 2.5 参考文献
• 1A-肾上腺素受体'>第三章 激动剂-量子点定位α_1A-肾上腺素受体
• 3.1 引言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 试剂
• 3.2.2 细胞培养及处理
• 3.2.3 仪器
• 1A-AR荧光图像的获取方法'>3.2.4 活细胞上α_1A-AR荧光图像的获取方法
• 1A-AR的比较'>3.2.5 不同链长的PE定位α_1A-AR的比较
• 3.2.6 特异性结合实验
• 1A-AR的比较'>3.2.7 激动剂和拮抗剂标记α_1A-AR的比较
• 1A-AR的内吞'>3.2.8 不同孵育时间α_1A-AR的内吞
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 PE的生物素衍生化
• 1A-AR'>3.3.2 生物素化的PE定位α_1A-AR
• 1A-AR'>3.3.2.1 不同链长的PE-QD定位α_1A-AR
• 3.3.2.2 PE（D）与QD结合的有效性
• 1A-AR的特异性'>3.3.2.3 PE（D）-QD定位α_1A-AR的特异性
• 1A-AR的比较'>3.3.3 激动剂和拮抗剂作用于α_1A-AR的比较
• 1A-AR的内吞'>3.3.4 不同孵育时间下α_1A-AR的内吞
• 3.4 结论
• 3.5 参考文献
• 第四章 肾上腺素类药物的高特异性筛选
• 4.1 前言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 试剂
• 4.2.2 细胞培养及处理
• 4.2.3 仪器
• 1A-AR荧光图像的获取方法'>4.2.4 活细胞上α_1A-AR荧光图像的获取方法
• 1A-AR的QD荧光标记'>4.2.5 α_1A-AR的QD荧光标记
• 4.2.6 五种拮抗剂的亲和力比较
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 10倍待筛选拮抗剂作用于细胞
• 4.3.2 20倍待筛选拮抗剂作用于细胞
• 4.3.3 50倍待筛选拮抗剂作用于细胞
• 4.3.4 100倍待筛选拮抗剂作用于细胞
• 4.3.5 与经典放射方法的比较
• 4.4 结论
• 4.5 参考文献
• 致谢
• 硕士期间发表论文
• 学位论文评阅及答辩情况表