人的红细胞与精子冷冻干燥保存实验研究

论文摘要

由于冷冻干燥法具有其他长期保存法无法比拟的一些优点，该方法己成为细胞长期保存方法中新的研究热点。但影响冻干细胞回收率的因素非常多，包括保护剂组成(成份和浓度)、添加洗涤方式、冷冻过程、干燥过程和复水等。本论文将围绕细胞冻干中的损伤机理这一条主线展开讨论，通过大量的实验研究这些因素对人的红细胞和精子冻干效果的影响，利用热物理中一些测量仪器和手段，并运用一些分析透过细胞膜传质和胞内冰晶形成的数学物理模型，深入探讨各种冻干损伤机理，并对人红细胞和精子冻干方法进行优化。 (1)目前文献中采用的红细胞冻干保护剂在种类和浓度上相差非常大，回收率也相差较大，并普遍不高。其原因是大家对红细胞膜的渗透响应特性还不是很了解。本文中实验研究了红细胞膜的脆性和渗透响应极限，寻找最佳保护剂添加、洗涤方法。通过实验比较，获得适合于红细胞的保护剂最佳添加洗涤方法。利用此最佳添加洗涤方法将不同浓度保护剂添加洗涤，检测红细胞溶血率，寻找红细胞所能承受的渗透压极限。若保护剂渗透压高于此极限值，红细胞在保护剂添加和洗涤过程中的渗透性损伤就会很大，即使不经历冻干过程，细胞就已损失严重。利用KK方程理论模拟渗透性和非渗透性保护剂以不同方式添加、洗涤过程中细胞体积响应，从理论上寻找最佳添加、洗涤方式。分析解释理论模拟结果和实验结果的相同处和不同处。该部分工作同时也为复水程序优化提供理论指导，即采用慢速复水可减小细胞体积变化造成的损伤，而目前文献中复水基本上均采用直接快速复水法(这可能是造成文献中细胞回收率不高的一个重要原因)。 (2)实验比较不同渗透性保护剂成份、聚合物、降温速率等因素对红细胞冻干后回收率的影响，优化冻干保护剂和程序。利用差式扫描量热仪测定不同保护剂的相变温度，分析保护剂的相变性质对冻干保存效果的影响。并利用KK方程和修正的胞内冰形成模型对透膜传质与胞内溶液相变进行数值模拟，为实验提供理论指导和预测。为分析不同保护剂在添加洗涤过程中的渗透性损伤差别，利用KK方程模拟

论文目录

摘要

Abstract

符号表

第一章绪论

1.1 研究背景

1.1.1 细胞与组织的长期保存简介

1.1.2 冷冻干燥保存

1.1.2.1 冷冻干燥保存原理

1.1.2.2 冷冻干燥保存研究历史

1.1.2.3 冷冻干燥保存研究意义

1.2 细胞冷冻干燥保存研究现状

1.2.1 细胞冷冻干燥保存的一般步骤及要点

1.2.2 红细胞冷冻干燥保存研究现状

1.2.3 精子冷冻干燥保存研究现状

1.3 细胞冷冻干燥保存过程的数值模拟

1.3.1 去除、添加保护剂

1.3.2 降温过程中的模型

1.3.3 升华干燥过程的模拟

1.4 本论文研究内容

1.5 参考文献

第二章人红细胞冷冻干燥保存中的渗透性损伤分析

2.1 前言

2.2 本章概要

2.3 红细胞的获取、处理、常规检测及所使用的仪器

2.3.1 红细胞的获取和洗涤

2.3.2 血红素回收率检测与分光光度计

2.3.3 血细胞分析仪

2.3.4 Bradford法测定蛋白总浓度及红细胞回收率

2.4 保护剂添加方式的比较

2.4.1 不同渗透压的NaGl溶液的配备

2.4.2 向红细胞悬浮液添加NaCl溶液方法的比较

2.4.3 不同浓度NaCl溶液添加后Hb溶血率的测定

2.4.4 以不同方式添加后Hb溶血率实验结果

2.5 保护剂洗涤方法的比较

2.5.1 按不同方式洗涤红细胞

2.5.2 不同方式洗涤后细胞Hb溶血率结果

2.6 保护剂添加洗涤后红细胞溶血率与渗透压关系的实验

2.6.1 实验方法

2.6.2 不同浓度NaCl溶液添加洗涤后的细胞损伤实验结果

2.7 KK方程对以不同方式添加洗涤保护剂的模拟

2.8 人的红细胞冻干中渗透性损伤讨论

2.8.1 保护剂不同添加和洗涤方式的比较

2.8.2 红细胞冻干保存中所能承受的渗透压极限

2.8.3 冻干红细胞复水洗涤时的渗透性损伤

2.9 本章小结

2.10 参考文献:

第三章人红细胞冻干保存中保护剂选择和冻干程序优化

3.1 引言

3.2 本章概要

3.3 真空冷冻干燥机（Advantage EL,Virtis,USA）

3.4 人红细胞冻干保护剂的比较和选择

3.4.1 渗透性保护剂的比较

3.4.2 聚合物PVP和HES的比较

3.4.3 冻干保护剂组成

3.5 人红细胞冻干程序的优化

3.5.1 搁板最低温度的设置

3.5.2 干燥程序的选择

3.5.3 不同降温速率的比较

3.5.4 用修正的胞内冰形成模型对不同Lp下低温损伤的模拟

3.5.5 本节讨论

3.6 本章小结

3.7 参考文献

第四章冻干人红细胞复水及复水损伤机理探讨

4.1 引言

4.2 本章概要

4.3 不同复水溶液的比较

4.3.1 材料与方法

4.3.2 结果与讨论

4.4 不同复水温度的比较

4.4.1 保护剂的配制与红细胞的冻干、保存

4.4.2 冻干红细胞样品的扫描电镜观测

4.4.3 冻干红细胞不同温度下复水及回收率测定

4.4.4 实验结果

4.4.5 本节讨论

4.5 不同复水速度（蒸汽预复水与直接复水）的比较

4.5.1 红细胞的冷冻干燥与保存

4.5.2 蒸汽预复水与直接复水

4.5.3 复水后血红素（Hb）回收率洲定

4.5.4 PVP组样品洗涤后细胞恢复率指标测定

4.5.5 本节讨论

4.6 干燥人红细胞膜相变及复水时膜相变损伤机理探讨

4.6.1 干燥红细胞血影的制备和干燥

4.6.2 干燥红细胞血影相变温度测定

4.6.3 干燥红细胞血影相变温度

4.6.4 本节讨论

4.7 冻干红细胞复水时体积响应及体积变化损伤机理探讨

4.7.1 材料与方法

4.7.2 实验结果

4.7.3 本节讨论

4.8 本章小结

4.9 参考文献

第五章人的精子冷东干燥保存保护剂的初步优化

5.1 引言

5.2 本章概要

5.3 材料与方法

5.3.1 冻干保护剂的配制

5.3.2 人精子的获取和预处理

5.3.3 冻干保护剂的添加

5.3.4 人精子的冻干

5.3.5 冻干样品的复水和保护剂的洗涤

5.3.6 伊红Y染色实验

5.3.7 低渗膨胀检测实验

5.3.8 人精子形态的电镜观察

5.4 实验结果

5.4.1 冻干复水后人精子的伊红Y染色实验

5.4.2 冻干复水后人精子的低渗膨胀实验

5.4.3 冻干复水后人精子形态的电镜观测

5.5 不同保护液的相变性质测定

5.6 讨论

5.7 冻干精子复水后微注射与受精能力检测简介

5.8 本章小结

5.9 参考文献:

第六章结论与展望

6.1 本文主要结论

6.2 进一步工作展望

致谢

攻读博士学位期间发表论文

攻读博士期间参与的国际会议

攻读博士学位期间参与的科研项目

攻读博士学位期间所受到奖励

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