微型中空纤维反应器用于药物肝毒性研究

论文摘要

随着大量新药的发明,亟需各种有效的模型来评价药物的肝毒性。传统的动物模型有时间长、操作繁琐与费用高的缺点,不适用于药物肝毒性的高通量筛选。近来,各种体外药物代谢模型受到了广泛关注,在药物肝毒性研究中,大多采用规模趋向微型化的多孔板原代肝细胞培养法。但多孔板培养细胞不能长期保持肝细胞特异功能,这制约了原代肝细胞模型在药物研究中的应用。本实验的目的在于寻找新的适合药物肝毒性研究的原代肝细胞模型,希望能代替多孔板培养法应用于药物肝毒性的研究中。 本文分五个部分。第一部分综述了与肝毒性相关的新药筛选现状和存在的问题,以及肝细胞体外培养的研究进展。并提出了本文的研究思路:将大型的生物人工肝反应器微型化,建立一种细胞三维培养的微型反应器,用于体外药物肝毒性的研究。 第二部分通过一系列定性和定量实验寻找合适的材料构建微型反应器。得到了一种由100KDa聚砜中空纤维丝,透气硅胶管,硅胶塞构成的微型反应器,并以鼠尾胶原为包埋基质将细胞培养于中空纤维丝腔内。包埋于此种反应器内的大鼠肝细胞能存活14天以上,而且能较好保持肝细胞功能和CYP450活性。 第三部分主要评价微型反应器用于药物肝毒性研究的可行性。结果发现微型中空纤维反应器对不同浓度（2.5-20 mmol/L）醋氨酚毒性的敏感性均高于单层培养方式,并更接近体内药物毒性实验的结果,说明此种培养方式能较好保持CYP450酶活性并能模拟体内微环境。本实验还采用低浓度的利福平（10 mg/L）和异烟肼（15 mg/L）考察了微型中空纤维反应器用于药物低剂量长期肝毒性研究的可行性,发现药物对中空纤维反应器包埋细胞的肝毒性在用药3天后才能观察到,而单层贴壁细胞在5天的培养中未发现有明显的药物肝毒性。 第四部分讨论了微型中空纤维反应器作为体外保肝药物模型的可行性。实验选用醋氨酚作为肝毒性药物,谷胱甘肽作为保肝药物,结果发现,对于单层贴壁培养的细胞,谷胱甘肽的保护作用在加药24h后开始下降,而对于微型中空纤维反应器包埋细胞,谷胱甘肽的保护作用能持续5天。该结果预示,微型中空纤维反浙江大学硕士论文应器能更好保持与GSH保肝作用相关的酶活性,是一种比单层培养更合适的体外保肝药物研究模型。 第五部分总结全文并展望了微型中空纤维模型用于药物代谢研究、中药筛选研究和以人肝细胞代替大鼠肝细胞用于临床药物反应预测研究的应用前景。 关键词:酚利福平大鼠肝细胞微型中空纤维反应器单层贴壁培养药物肝毒性醋氨异烟脱谷肤甘肤

论文目录

• 前言
• 第一章 文献综述
• 1.1.肝脏与药物肝毒性
• 1.1.1.肝毒性药物醋氨酚、利福平、异烟肼的毒性机理
• 1.1.2.谷胱甘肽对醋氨酚肝毒性的解毒作用机理
• 1.2.新药筛选中与药物肝毒性相关的研究进展
• 1.2.1.连续细胞系应用于药物筛选的优缺点
• 1.2.2.原代肝细胞应用于药物筛选的优缺点
• 1.3.肝细胞的体外培养研究现状
• 1.3.1.单层贴壁培养（Monolayer Culture）
• 1.3.2.三维组织化培养（Three-Dimensional Culture）
• 1.4.研究思路
• 1.4.1.建立一种适用于药物高通量筛选的三维培养微型肝细胞反应器
• 1.4.2.评价微型反应器用于药物肝毒性和解毒作用研究的可行性
• 第二章 材料与方法
• 2.1.动物与细胞株
• 2.2.试剂与器材
• 2.2.1.主要试剂
• 2.2.2.主要器材
• 2.3.培养基与所用溶液配方
• 2.3.1.大鼠肝细胞培养基
• 2.3.2.L929细胞培养基
• 2.3.3.浓缩培养基
• 2.3.4.磷酸缓冲液（PBS）
• 2.3.5.灌注液Ⅰ
• 2.3.6.灌注液Ⅱ
• 2.3.7.低碳酸盐培养基
• 2.4.大鼠肝细胞收获方法
• 2.5.肝细胞计数法
• 2.6.肝细胞平皿单层培养
• 2.7.细胞胶原凝胶包埋
• 2.8.分析方法
• 2.8.1.尿素分析
• 2.8.2.大鼠白蛋白分析
• 2.9.细胞形态观察和活率
• 2.9.1.台盼兰拒染法
• 2.9.2.MTT法
• 2.9.3.EB／FDA荧光染色法
• 第三章 构建用于药物肝毒性研究的微型反应器
• 3.1.寻找适合细胞培养的材料和包埋基质
• 3.1.1.中空纤维丝材质和截留分子量的选择
• 3.1.2.包埋基质的选择
• 3.2.微型中空纤维反应器传氧和传质性能的定性研究
• 3.2.1.微型中空纤维反应器构型和参数
• 3.2.2.以细菌生长情况表征微型中空纤维反应器硅胶管外壳的传氧性能
• 3.2.3.采用L929细胞凝胶包埋进一步研究中空纤维丝的传氧和传质性能
• 3.3.微型中空纤维反应器包埋、细硅胶管包埋和单层贴壁三种培养方式下大鼠肝细胞存活时间和细胞活性的研究
• 3.4.本章小结
• 第四章 微型中空纤维反应器用于醋氨酚、异烟肼和利福平肝毒性研究
• 4.1.微型中空纤维反应器用于醋氨酚肝毒性的研究
• 4.1.1.不同浓度的醋氨酚对单层贴壁培养细胞的肝毒性作用
• 4.1.2.醋氨酚对微型中空纤维反应器凝胶包埋大鼠肝细胞的肝毒性作用
• 4.1.3.醋氨酚对细硅胶管凝胶包埋大鼠肝细胞的肝毒性作用
• 4.1.4.醋氨酚作用下大鼠肝细胞三种不同培养方式的比较
• 4.2.微型中空纤维反应器用于利福平、异烟肼的肝毒性研究
• 4.2.1.利福平和异烟肼对单层贴壁培养细胞的肝毒性作用
• 4.2.2.利福平和异烟肼对微型中空纤维反应器培养细胞的肝毒性作用
• 4.3.本章小结
• 第五章 微型中空纤维反应器作为体外保肝药物模型的初步研究
• 5.1.GSH对于醋氨酚引起的药物肝毒性的解毒作用的研究
• 5.1.1.不同浓度醋氨酚和谷胱甘肽作用于微型中空纤维反应器和单层培养的条件实验
• 5.1.2.GSH对于单层贴壁培养细胞药物肝毒性的解毒作用
• 5.1.3.GSH对于中空纤维丝凝胶包埋培养细胞药物肝毒性的解毒作用
• 5.1.4.本章小结
• 第六章 结论与展望
• 参考文献
• 致谢