池蝶蚌外套膜组织学及钙调蛋白基因的克隆和表达特性分析

论文摘要

池蝶蚌（Hyriopsis schlegeli）作为一种引进的优质的淡水育珠蚌,已经广泛应用于我国的淡水育珠产业中。贝类培育珍珠的重要部位是外套膜,然而到目前为止,有关池蝶蚌外套膜的组织学结构的研究还未见有报道,并且对参与和调控淡水珍珠形成的基因研究也属空白。本研究用传统的石蜡切片和H.E染色技术对池蝶蚌外套膜不同部位的组织结构进行了详细的观察,并对不同部位边缘突起的厚度、形状、面积进行了研究,同时成功克隆了池蝶蚌钙调蛋白cDNA的全长序列,并对其表达特性进行了分析。1、池蝶蚌外套膜的组织结构观察运用组织学方法对池蝶蚌外套膜不同部位进行了观察。结果表明,池蝶蚌外套膜由边缘膜和中央膜组成,边缘膜包括三个突起,分别是生壳突起,感觉突起和缘膜突起。外套膜不同部位的组织结构基本相同,由外表皮、内表皮、结缔组织和肌肉纤维组成。研究发现不同部位边缘突起的形状、面积等有较大差异,厚度也不同,一般是蚌体中部和中后部较厚。内表皮细胞间分布有三种类型的分泌细胞,分别是嗜碱性粘液细胞、大分泌颗粒细胞和小分泌颗粒细胞。而外表皮上只分布一种空泡状分泌细胞。2、池蝶蚌钙调蛋白基因的克隆与表达特性分析钙调蛋白（Calmodulin,CaM）是普遍存在于真核生物体内的小分子钙离子结合蛋白,通过与Ca2+结合,并与靶酶相互作用,参与细胞的多种生理活动。在贝类中,钙调蛋白作为钙离子通道的成员,以及Ca2+-ATPase系统中至关重要的调节者,在钙离子的获取和转运以形成贝壳的调节过程中起着重要作用。根据在NCBI数据库中寻找相近物种的钙调蛋白基因序列,设计引物,利用RT-PCR技术获得钙调蛋白基因的部分序列。同时根据已获得的序列,设计引物,利用SMART RACE技术分别获得3’端序列和5’端序列,拼接后获得池蝶蚌CaM基因的cDNA全长为855 bp,开放阅读框（ORF）447 bp,编码149个氨基酸,预测分子量为16.8 kDa,等电点为4.14。5’非编码区含70 bp,3’非编码区含309 bp,以及一个由26个A组成的poly（A）尾。与其它物种钙调蛋白基因一样,池蝶蚌CaM含有4个EF-hand结构域,每个结构域中含有2个α螺旋和1个钙离子结合区域。经过序列比对发现其氨基酸序列与其它物种具有很高的同源性。运用荧光定量PCR技术分析检测cam基因在池蝶蚌不同组织中的表达情况,结果表明在池蝶蚌的外套膜、鳃、性腺、斧足、闭壳肌5种组织中均检测到cam基因的表达,但不同组织中其表达量是有显著差异的。以闭壳肌中cam基因的表达量为参照,鳃中cam的表达量最高,是闭壳肌中的106倍;其次是斧足和外套膜,表达量也相当高,是闭壳肌中的60-80倍;性腺中的也高于闭壳肌中的表达。这5种组织中闭壳肌中cam基因的表达量最低。同时,还运用荧光定量PCR技术分析检测cam基因在不同年龄池蝶蚌外套膜组织中的表达情况,结果表明在池蝶蚌不同年龄的外套膜中,cam基因的表达是有变化的。以2龄池蝶蚌外套膜中cam基因的表达量为参照,4龄的表达量最高,其次是5龄的,1龄、2龄、3龄池蝶蚌外套膜中cam基因的表达没有显著差异。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 引言
• 1.1 贝类的钙代谢
• 1.2 与贝壳形成相关蛋白的研究情况
• 1.2.1 基质蛋白
• 1.2.2 钙调蛋白
• 1.3 贝类外套膜与贝壳形成的关系
• 1.3.1 外套膜的组织学研究进展
• 1.3.2 外套膜与生物矿化的关系
• 1.3.3 外套膜与钙代谢
• 1.4 本研究的目的意义
• 第2章 池蝶蚌外套膜的组织学观察
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料和方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 方法
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 边缘膜的组织结构
• 2.3.2 不同部位边缘膜主体部分厚度的比较
• 2.3.3 内表皮
• 2.3.4 结缔组织
• 2.3.5 肌纤维
• 2.3.6 外表皮
• 2.3.7 中央膜的组织结构
• 2.4 讨论
• 第3章 池蝶蚌钙调蛋白基因的克隆与表达特性研究
• 3.1 前言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 主要设备和仪器
• 3.2.2 主要试剂
• 3.2.3 实验材料
• 3.2.4 RNA的提取与质量检测
• 3.2.5 RT-PCR
• 3.2.6 PCR产物纯化
• 3.2.7 SMART cDNA的合成
• 3.2.8 RACE-PCR扩增CaM基因的cDNA全长
• 3.2.9 目的片段的回收
• 3.2.10 回收片段与T载体连接
• 3.2.11 制备大肠杆菌感受态细胞
• 3.2.12 连接产物转化大肠杆菌感受态细胞
• 3.2.13 转化后的阳性克隆的筛选
• 3.2.14 菌落PCR鉴定阳性克隆
• 3.2.15 序列分析
• 3.2.16 荧光定量PCR检测池蝶蚌不同年龄、不同组织钙调蛋白基因表达
• 3.3 结果
• 3.3.1 RNA的提取
• 3.3.2 PCR产物的检测
• 3.3.3 RACE-PCR
• 3.3.4 池蝶蚌钙调蛋白cDNA全长序列
• 3.3.5 池蝶蚌钙调蛋白氨基酸的组成分析
• 3.3.6 池蝶蚌钙调蛋白亲水性与疏水性分析
• 3.3.7 池蝶蚌钙调蛋白与其他物种进行同源性分析
• 3.3.8 池蝶蚌钙调蛋白结构域分析
• 3.3.9 荧光定量PCR检测池蝶蚌不同组织钙调蛋白基因的表达
• 3.3.10 荧光定量PCR检测不同年龄池蝶蚌钙调蛋白基因的表达
• 3.4 分析与讨论
• 第4章 小结
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间的研究成果