论文摘要
目的:增殖型糖尿病视网膜病变（proliferative diabetic retinopathy,PDR）作为糖尿病严重并发症之一已成为糖尿病患者致盲的首位原因。PDR最主要标志是新生血管形成,可发生在视盘上或其附近,也可能在视网膜,主要沿血管弓生长。新生血管是引起出血的主要原因,包括视网膜前出血和玻璃体出血。目前视网膜新生血管形成的机制还未完全清楚,但任何病理改变在本质上均是体内动态平衡的失调,新生血管的形成亦然。近年来的研究表明新生血管的自身稳定由两种物质的平衡系统所调节:血管刺激因子系统和血管抑制因子系统。目前血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）和色素上皮衍生因子（pigment epithelium derived factor,PEDF）被认为是血管刺激因子系统和血管抑制因子系统的一对典型代表。二者之间的平衡对新生血管的调节十分重要。研究发现在PDR患者的房水和玻璃体液中PEDF水平下降,VEGF水平升高[1-3]。免疫组化结果显示PDR患者视网膜内PEDF水平明显低于明显低于对照组[1]。但关于PDR患者纤维血管膜中PEDF和VEGF的表达的研究却鲜见报道。本研究通过免疫组化方法检测增殖型糖尿病视网膜病变（PDR）患者纤维血管膜标本中PEDF和VEGF因子的表达情况,以探讨二者与PDR发生、发展的关系及在PDR病理过程中的相互作用,为PDR的进一步治疗提供理论依据。材料与方法:1取材25例PDR患者玻璃体手术均使用日本TOPCON公司玻璃体切割机,切速600～15O0次·min,吸力40kPa,切割灌注液为眼用平衡盐液。术中用视网膜剪和镊获得PDR膜组织,约2.0mm×2.0mm×0.5mm,立即用40g·L多聚甲醛溶液固定。常规酒精脱水,二甲苯透明,浸蜡包埋,5μm连续切片,编号备用,载玻片涂APES胶,以防脱片。2免疫组织化学染色采用辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素染色系统（LSAB法）。（1）切片常规脱蜡至水,0.01mol·L PBS漂洗5min×3次;（2）3%H2O2甲醇溶液,室温10min,以阻断内源性过氧化物酶活性,PBS漂洗5min×3;（3）抗原修复,切片置0.01mol·L枸橼酸缓冲液中,微波炉加热92～98℃,持续10min,室温冷却10～30min,PBS漂洗5min×3;（4）滴加2%正常羊血清,37℃孵育10min。去多余液体,不洗;（5）滴加一抗（PEDF 1:100,VEGF 1:40）,37℃湿盒内孵育2小时,PBS漂洗5min×3（;6）滴加生物素标记二抗,37℃10min,PBS漂洗5min×3;（7）滴加辣根过氧化酶标记链霉亲和素37℃10min,PBS漂洗5min×3;（8）AEC显色,甲基绿淡染核,脱水,透明,封片。光学显微镜下阅片,照相。每例标本均设有PBS替代第一抗体的阴性对照。结果:术后视力除6例与术前相同外,其余19例均有不同程度的提高,最好视力达0.2。25例患者眼均伴有牵拉性视网膜脱离,其中15例同时伴玻璃体出血（见Fig.1A）,称为活动期;另外10例不伴玻璃体出血（见Fig.2A）,称为静止期。25例膜组织中23例阳性,2例弱阳性。1.HE染色结果显示增殖膜形式多样,在活动期增殖膜中（见Fig.1B）可见多数小血管和红细胞及上皮细胞样和成纤维细胞样增殖细胞和纤维细胞,偶可见单核/巨噬细胞,中性粒细胞及淋巴细胞.在静止期增殖膜中（见Fig.2B）多见无细胞、相对致密的纤维膜,以及环绕增殖细胞的膜结构,大多数增殖膜疏密不均,各种细胞散乱其中,纤维条索可见。2.免疫组化结果显示（见Fig.1C,D,Fig2C,D）, 25例PDR纤维血管膜组织中23例阳性,2例弱阳性。总阳性率为80%以上.2.1 VEGF在新生血管内皮细胞中呈高表达状态,而在细胞外基质和纤维细胞中几乎没有表达,活动期组VEGF的表达阳性率为88.1%±19.1%,静止期组为43.2%±10.2%,前者明显高于后者。2.2与VEGF的表达相反,PEDF主要在细胞外基质和围绕新生血管的纤维组织中呈高表达状态,而不在新生血管内皮细胞中表达。活动期组PEDF的表达阳性率为89.8%±14.5%,静止期组为51.0%±12.3%。活动期组也明显高于静止期组。结论:本实验的研究结果表明,VEGF在新生血管内皮细胞中呈高表达状态,而在细胞外基质中几乎没有表达,与VEGF相反,PEDF主要在细胞外基质和围绕新生血管的纤维组织中呈高表达状态,而不在新生血管内皮细胞中表达.二者在活动期组的表达阳性率均明显高于静止期组。VEGF和PEDF在活动期组即伴有眼内玻璃体出血的PDR患者的纤维血管膜中的表达升高提示二者可能在调控PDR纤维血管膜的形成进展方面发挥着重要作用。提示二者的异常表达可能促使了增殖型糖尿病视网膜病变纤维血管膜的形成。
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