适合转基因抗虫水稻和棉花PCR检测标准质粒的构建及试用

论文摘要

在转基因检测领域,标准质粒以容易获得、纯度高、成本低和稳定性好的优点逐渐发展成为受欢迎的一种标准物质（替代品）,更适合同时对多个靶标基因的检测。为解决阳性标准物质不容易获得的困难,本研究构建了适合常见转基因水稻和棉花产品PCR检测的四个标准质粒,以我国4个转基因水稻品系和16个转基因棉花品种（品系）为研究材料,对其作为标准物质在转基因检测中的适用性进行了初步验证。主要结果如下:1.构建了适合于转基因抗虫水稻科丰6号品系特异性检测的标准质粒pMD-KF6,建立了相应的实时荧光定量PCR检测方法。该质粒全长为3100 bp,通过在pMD18-T载体的克隆位点和HindIII酶切位点分别插入gos9序列和科丰6号5?端旁侧序列构建,为闭合环状双链DNA。建立了基于5?端旁侧序列的科丰6号产品品系特异性实时荧光定量PCR方法。5?旁侧和gos9两个标准曲线的相关系数（R2）分别为0.999和0.998,扩增效率（E）分别为96.8%和97.2%,定量检测限为10个拷贝。对5%和1%两个混合样品进行定量检测,评价和验证所建立的定量方法,结果显示准确性偏离率分别为4.0%和17.0%,精确性相对标准差（RSD）分别为3.96%和3.42%。表明本研究建立的PCR定量检测方法可以用于含有科丰6号转基因水稻产品的品系特异性定量检测,所构建的标准质粒pMD-KF6可以代替其基因组DNA作为标准物质使用。2.构建了适合于转基因抗虫水稻Bt汕优63品系特异性检测的标准质粒pMDBt63,建立了相应的实时荧光定量PCR检测方法。该质粒全长3137 bp,通过在pMD18-T载体的克隆位点和EcoRⅠ酶切位点分别插入gos9序列和Bt汕优63 3?端旁侧序列构建。基于3?端旁侧序列的Bt汕优63产品品系特异性实时荧光定量PCR方法的两个标准曲线的相关系数（R2）分别为0.9997和0.9992,扩增效率（E）分别为98.05%和99.46%。检测限为10拷贝,定量限为100拷贝。应用建立的方法对5%和1%两个混合样品进行定量检测结果的准确性偏离率（bias）分别为0.02和0.07,相对标准差（RSD）分别为1.23%和5.61%。以上结果表明,本研究建立的PCR定量检测方法可以用于含有Bt汕优63转基因水稻产品的品系特异性定量检测,所构建的标准质粒pMDBt63可以代替其基因组DNA作为标准物质使用。3.结合对多靶标进行PCR定量检测的技术要求,探索构建了适合于克螟稻等4个转基因抗虫水稻品系特异性检测的多靶标标准质粒pMD68DH,建立了相应的实时荧光定量PCR检测方法。该质粒全长为5152 bp,通过在pMD18-T载体的克隆位点以及载体上的EcoRⅠ、BamHⅠ、HindIII 3个酶切位点分别插入四个转基因水稻5?和3?端旁侧序列以及水稻gos9、PLD和SPS三个内标准基因序列构建。为验证pMD68DH用于多个转基因水稻产品定量检测的适用性,以科丰8号和克螟稻水稻样品DNA为检测对象,选择gos9基因作为定量的内标准基因,分别建立了针对科丰8号和克螟稻2个抗虫水稻产品的品系特异性定量PCR检测方法。定量检测限均为10拷贝。应用所建立的PCR检测方法分别对5%和1%两个转基因含量的科丰8号和克螟稻水稻样品DNA进行了定量检测验证。科丰8号定量检测结果标准偏差分别为21.6%和7.0%,精确性相对标准差分别为2.3%和7.48%。克螟稻定量检测结果的准确性标准偏差分别为2.8%和1.0%,精确性相对标准差分别为3.29%和7.92%。以上结果表明,pMD68DH适合作为标准物质（替代品）用于有关转基因水稻产品的PCR定量检测。4.针对我国转基因抗虫棉常用的主要转基因元件和外源基因类型,结合对多靶标对象进行PCR定量检测的技术要求,构建了适合于我国目前转基因抗虫棉花产品检测的多靶标标准质粒pMDMCS,建立了针对不同靶标对象的实时荧光定量PCR检测方法。该质粒全长为4309 bp,在pMD20-T载体基础上构建,包括CaMV35S启动子、pNOS启动子、NOS终止子、7S终止子、nptII标记基因、CpTI抗虫基因和cry1A抗虫基因等7个外源基因靶标序列和棉花内标准Sad1基因序列。根据上述cry1A抗虫基因等转基因检测靶标序列和Sad1棉花内标准基因对多靶标序列PCR定量检测的技术要求,研究建立了针对不同靶标的实时荧光定量PCR方法。经测试,所建立的定量标准曲线相关参数均符合PCR定量检测要求。以这些方法对我国16个抗虫棉品种（品系）样品中7个检测对象进行了PCR定量检测的实验应用。定量结果表明,CaMV35S启动子、NOS终止子、7S终止子、nptII标记基因及cry1A抗虫基因在我国抗虫棉品种中较为稳定存在,pNOS启动子和CpTI抗虫基因剂量均低于0.3拷贝。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 转基因作物及其安全管理
• 1.1.1 转基因作物全球种植情况
• 1.1.2 我国转基因作物研发情况
• 1.1.3 转基因作物的安全性及标识管理制度
• 1.2 转基因作物PCR 检测方法研究进展
• 1.2.1 针对不同靶标的PCR 检测策略
• 1.2.2 定性PCR 检测技术
• 1.2.3 实时荧光定量PCR 方法
• 1.3 植物内标准基因的应用
• 1.3.1 植物内标准基因的作用
• 1.3.2 植物内标准基因研究进展
• 1.4 质粒分子作为标准物质的研究与应用
• 1.4.1 标准物质
• 1.4.2 质粒分子
• 1.5 本研究的意义和内容
• 第二章 抗虫水稻科丰6 号定量检测标准质粒构建及试用
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料和 DNA 提取
• 2.1.2 菌株和载体
• 2.1.3 酶和试剂
• 2.1.4 主要实验仪器、设备
• 2.1.5 引物和探针
• 2.1.6 标准质粒构建
• 2.1.7 已知含量的科丰6 号混合样品的制备
• 2.1.8 常规PCR 条件
• 2.1.9 定量 PCR 条件
• 2.2 结果和分析
• 2.2.1 标准质粒构建
• 2.2.2 PMD-KF6 作为阳性对照的定量引物特异性验证
• 2.2.3 PMD-KF6 作为标准物质的标准曲线的建立
• 2.2.4 定量方法的验证
• 2.2.5 不同混合样品的实际定量结果
• 2.3 讨论
• 2.3.1 引物和探针设计
• 2.3.2 标准质粒在科丰6 号定量检测中的应用
• 2.3.3 定量分析方法的评价
• 第三章 抗虫水稻BT 汕优63 定量检测标准质粒构建及试用
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料和 DNA 提取
• 3.1.2 菌株和载体
• 3.1.3 酶和试剂
• 3.1.4 主要实验仪器、设备
• 3.1.5 引物和探针
• 3.1.6 标准质粒构建
• 3.1.7 已知含量的 BT 汕优63 混合样品的制备
• 3.1.8 常规 PCR 条件
• 3.1.9 定量 PCR 条件
• 3.2 结果和分析
• 3.2.1 标准质粒构建
• 3.2.2 PMDBT63 作为阳性对照的定量引物特异性验证
• 3.2.3 PMDBT63 作为标准物质的标准曲线的建立
• 3.2.4 定量方法的验证
• 3.2.5 已知浓度混合样品的定量检测
• 3.3 讨论
• 3.3.1 靶标序列的选择和引物探针设计
• 3.3.2 标准曲线的建立
• 3.3.3 定量分析方法的评价
• 第四章 适合四种抗虫水稻定量检测标准质粒的构建及试用
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料与 DNA 提取
• 4.1.2 菌株和载体
• 4.1.3 酶和试剂
• 4.1.4 主要实验仪器、设备
• 4.1.5 标准质粒构建
• 4.1.6 构建的质粒分子作为标准物质用于转基因水稻定量检测的适用性
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 标准质粒构建
• 4.2.2 PMD68DH 作为阳性对照的定量引物特异性验证
• 4.2.3 PMD68DH 作为标准物质的科丰8 号和克螟稻定量方法建立及验证
• 4.2.4 混合样品的定量分析
• 4.3 讨论
• 4.3.1 基因重组技术在标准质粒构建中的应用
• 4.3.2 靶标序列的选择和引物、探针设计
• 4.3.3 定量方法的评价
• 第五章 适合转基因棉通用元件、外源基因剂量测定标准质粒的构建及试用
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 供试材料和 DNA 提取
• 5.1.2 菌株和载体
• 5.1.3 酶和试剂
• 5.1.4 主要实验仪器、设备
• 5.1.5 引物和探针
• 5.1.6 标准质粒构建
• 5.1.7 我国转基因棉花样品通用元件和外源基因剂量测定
• 5.1.8 定量条件
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 标准质粒的构建
• 5.2.2 标准曲线的建立
• 5.2.3 PMDMCS 作为标准物质的定量方法的可重复性和检测限
• 5.2.4 应用 PMDMCS 作为标准物质的转基因棉外源靶标基因剂量测定
• 5.3 讨论
• 5.3.1 实时荧光定量PCR 方法在我国转基因棉花基因剂量测定中的应用
• 5.3.2 定量方法的评价与分析
• 第六章 全文结论
• 参考文献
• 附录 1
• 附录 2
• 附录 3
• 致谢
• 作者简历