猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因DNA疫苗的构建与鼠体内免疫效力观察

论文摘要

猪圆环病毒（Porcine circovirus, PCV）为圆环病毒科圆环病毒属成员,PCV分为PCV1和PCV2两种基因型。PCV2具有致病性,不仅与近年来在世界各国普遍发生的断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome, PMWS）密切相关,而且还与猪皮炎肾病综合征、仔猪先天性震颤以及母猪繁殖障碍等疾病有关。PCV2除引起猪体发生原发感染甚至死亡之外,还侵害猪的淋巴系统,从而导致免疫抑制,继发感染猪猪繁殖与呼吸综合征、猪流感、猪瘟、猪伪狂犬等病毒性传染病,使疫情加重,已给全球养猪业造成相当严重的经济损失。目前国内外能有效防制本病的疫苗较少,因此,研制安全而有效的疫苗,将有利于彻底控制乃至根除PCV2。自从1990年出现基因免疫以来,已有许多病毒的保护性抗原基因被导入各种动物体内,产生了很好的免疫效果。DNA疫苗作为第3代疫苗,由于有着其独特的优点而受到研究人员的瞩目。但是DNA疫苗在机体内表达量低,单独使用所诱导机体产生的抗体水平,还不足以完全有效抵抗致死剂量病原体的攻击。怎样增强免疫保护效果成为目前DNA疫苗研究的关键。许多研究表明,IL-2、IFN-γ、IL-6、IL-18等细胞因子能增强抗原的免疫原性。真核双表达载体pIRES是双顺反子结构,具有两个多克隆位点（MCS A和B）。本研究根据真核表达载体pIRES启动子下游的MCS A的酶切位点和PCV2临颍株（LY株）全基因组核苷酸序列,设计、合成1对引物,PCR扩增PCV2 ORF2全基因。将XhoⅠ与MluⅠ双酶切获得的ORF2基因片段克隆到同样处理的真核表达载体pIRES中,构建重组真核表达质粒pIRES-ORF2。根据真核表达载体pIRES启动子下游的MCS B的酶切位点和重组质粒pGEM-T-PIL18、pGEM-T-PIL2中猪IL-18（PIL-18）、猪IL-2（PIL-2）基因核苷酸序列,设计、合成2对引物,扩增PIL-18、PIL-2全基因。将SalⅠ与NotⅠ双酶切获得的PIL-18、PIL-2基因片段分别重组到真核表达载体pIRES和pIRES-ORF2的MCS B酶切位点SalⅠ与NotⅠ之间,构建重组真核表达质粒pIRES-PIL18、pIRES-PIL2、pIRES-ORF2/PIL18和pIRES-ORF2/PIL2。为测定构建的编码PCV2衣壳蛋白ORF2基因与猪IL-18或猪IL-2基因联合免疫的试验效果,将pIRES-ORF2、pIRES-PIL18、pIRES-PIL2、pIRES-ORF2/PIL18与pIRES-ORF2/PIL2分别肌肉接种免疫6周龄雌性昆明小鼠,两周后加强免疫一次。二免后每周抽取外周血及外周抗凝血,应用ELISA和流式细胞仪分别检测免疫鼠的体液免疫及细胞免疫水平。二免疫后第1周用PCV2强毒进行攻击。结果显示,pIRES-ORF2、pIRES-ORF2/PIL18与pIRES-ORF2/PIL2免疫组均能诱导鼠产生特异性的体液免疫及细胞免疫应答,其中pIRES-ORF2/PIL18与pIRES-ORF2/PIL2免疫组的ELISA抗体水平和T淋巴细胞亚群CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+明显高于单独pIRES-ORF2免疫组（P<0.01）,能抵抗PCV2强毒的攻击。表明细胞因子能明显增强PCV2 DNA疫苗的免疫原性。

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• 文献综述
• 引言
• 试验一 猪圆环病毒 II 型病毒 ORF2 基因与猪白介素-18 基因真核共 表达载体的构建
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 试验二 猪圆环病毒 II 型病毒 ORF2 基因与猪白介素-2 基因真核共 表达载体的构建
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 试验三 猪圆环病毒II型病毒ORF2基因与猪白介素-18基因免疫保 护试验
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 试验四 猪圆环病毒 II 型病毒 ORF2 基因与猪白介素-2 基因免疫保 护试验
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 英文摘要
• 发表论文