番木瓜环斑病毒（PRSV）ci和nib反向重复结构表达载体的转化研究

论文摘要

番木瓜环斑病毒病是番木瓜的第一大病毒性病害,在世界范围内造成较大危害,目前还没有十分有效的化学药剂能控制PRSV病害,只能采取以栽培措施为主的综合防治措施。植物基因工程的快速发展为植物抗病提供了一条崭新而有效的方法,尤其是近年来RNAi领域研究的快速发展,利用反向重复表达载体对植物进行遗传转化成为研究植物抗病毒研究的一大热点。本研究以番木瓜胚状体、黄瓜子叶节作为转化材料,利用农杆菌介导法将反向重复表达载体pHellsgate-CIIR、pHellsgate-NIbIR导入到受体材料中,期望得到转基因植株。同时利用原生质体瞬时表达体系初步研究了反向重复表达载体对目标基因的沉默效果。主要研究结果如下：（1）对番木瓜下胚轴、叶柄、幼胚以及番木瓜愈伤组织进行胚状体诱导,仅从幼胚和愈伤组织上得到了番木瓜胚状体,其中以幼胚诱导产生的胚状体数量多,耗时短,40d左右即能从幼胚中诱导出胚状体,诱导率为20%。（2）以黄瓜子叶节为外植体建立了黄瓜再生体系,使用含有表达载体pHellsgate-CIIR、pHellsgate-NibIR的农杆菌侵染黄瓜子叶节,通过抗生素筛选,得到了黄瓜转化苗。（3）用PRSV病毒粒子与反向重复表达载体pHellsgate-CIIR共转化番木瓜原生质体,12、24、36、48h分别取样,经原生质体总RNA提取、RT-PCR检测,结果显示,对于只转化PRSV的原生质体,24h开始能够检测到病毒ci基因的表达,且随着时间延长,ci基因的表达量逐渐增多；对于PRSV与反向重复表达载体pHellsgate-CIIR共转化的番木瓜原生质体,没有检测到病毒ci基因的表达,说明重复表达载体pHellsgate-CIIR的产物能够抑制ci基因的表达。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 1 前言
• 1.1 番木瓜环斑病毒（PAPAYA RINGSPOT VIRUS）的研究进展
• 1.1.1 番木瓜环斑病的症状和危害
• 1.1.2 番木瓜环斑病毒病毒基因组特征
• 1.2 运动蛋白基因和复制酶基因研究进展
• 1.2.1 运动蛋白基因的研究进展
• 1.2.1.1 植物运动蛋白的类型和功能
• 1.2.1.2 运动蛋白介导的植物抗病性
• 1.2.1.3 PRSV编码的运动蛋白的特点
• 1.2.2 复制酶基因的研究进展
• 1.2.2.1 复制酶基因的结构和特点
• 1.2.2.2 复制酶基因介导的抗性研究
• 1.2.2.3 番木瓜环斑病毒复制酶的应用
• 1.3 RNAI（RNA INTERFERENCE）技术介导的抗病毒基因工程
• 1.3.1 RNAi的作用机制
• 1.3.2 RNAi技术的特点
• 1.4 RNAI技术在植物抗病性中的应用
• 1.5 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 细菌菌株、质粒和病毒样品
• 2.1.3 仪器与试剂
• 2.1.3.1 仪器
• 2.1.3.2 试剂
• 2.1.4 培养基
• 2.1.4.1 主要细菌培养基
• 2.1.4.2 主要植物培养基
• 2.1.5 PCR使用的引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 番木瓜的遗传转化
• 2.2.1.1 番木瓜茎尖无菌系的建立
• 2.2.1.2 番木瓜茎尖诱导愈伤
• 2.2.1.3 番木瓜胚状体的诱导
• 2.2.1.4 番木瓜胚状体的转化
• 2.2.2 黄瓜的遗传转化
• 2.2.2.1 黄瓜无菌苗的准备
• 2.2.2.2 黄瓜再生体系外植体的选择与确定
• 2.2.2.3 根癌农杆菌介导的黄瓜的遗传转化与抗性芽筛选培养
• 2.2.2.4 黄瓜抗性芽的伸长培养、生根培养、炼苗及移栽
• 2.2.3 PRSV粗提纯与番木瓜原生质体转化
• 2.2.3.1 番木瓜环斑病毒（PRSV）的粗提纯
• 2.2.3.2 番木瓜环斑病毒（PRSV）的粗制剂病毒浓度的计算
• 2.2.3.3 番木瓜原生质体的提取
• 2.2.3.4 细胞记数板测定原生质体的密度
• 2.2.3.5 原生质体转化
• 2.2.3.6 TransZol Up试剂盒提取番木瓜原生质体RNA
• 2.2.3.7 RT-PCR
• 3 实验结果
• 3.1 番木瓜胚状体的遗传转化
• 3.1.1 番木瓜茎尖无菌系的建立与茎尖愈伤组织的诱导
• 3.1.2 番木瓜胚状体的诱导
• 3.1.3 番木瓜胚状体的转化
• 3.2 黄瓜的遗传转化
• 3.2.1 黄瓜外植体的选择对黄瓜不定芽再生的影响
• 3.2.2 不同植物生长调节剂与AgN03配比对黄瓜不定芽再生的影响
• 3.2.3 黄瓜抗性芽的筛选培养
• 3.2.4 黄瓜抗性芽的伸长培养、生根培养、炼苗及移栽
• 3.3 PRSV粗提纯与原生质体转化
• 3.3.1 番木瓜环斑病毒（PRSV）的粗提存
• 3.3.2 番木瓜原生质体的提取
• 3.3.3 质粒、病毒粒子共转化原生质体的分子检测
• 4 讨论
• 4.1 农杆菌介导的遗传转化
• 4.1.1 外植体对遗传转化的影响
• 4.1.2 农杆菌的浓度与侵染时间对转化及转化后外植体再生的影响
• 4.2 番木瓜原生质体转化
• 4.2.1 原生质体与PRSV的提取
• 4.2.2 番木瓜原生质体的共转化与检测
• 4.2.3 原生质体瞬时表达体系在植物抗病研究中的应用
• 4.3 前景与展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录1 常用溶液与培养基配制
• 附录2 大肠杆菌感受态制备及转化方法
• 附录3 农杆菌感受态制备及转化方法
• 附录4 大肠杆菌质粒DNA提取方法
• 图版与说明