轮枝链霉菌产谷氨酰胺转胺酶生物合成研究

论文摘要

谷氨酰胺转胺酶（TGase）是一种催化酰基转移反应的转移酶,它可催化蛋白质分子内和分子间ε-（γ-谷酰胺）-赖氨酸的异型肽键的形成,改善食品的品质,目前已广泛应用于食品工业中,但是成本过高的问题严重制约了TGase的使用和推广。本文以轮枝链霉菌SK4.001为出发菌株,研究了以豆饼粉酶解液作为培养基氮源对TGase酶活的影响。实验发现,胰蛋白酶是水解豆饼粉较好的酶。发酵培养基中酶解液添加量为100%。在胰蛋白酶水解豆饼粉单因素实验的基础上,采用正交实验进行优化。优化后的最佳酶解条件为温度35℃, pH 8.5,豆饼粉浓度10%,加酶量1000U/g底物。按此条件进行酶解,所获得的酶解物作为轮枝链霉菌产TGase发酵培养基的氮源,发酵42h后,酶活达到最高为5.04U/mL。因此,豆饼粉酶解物可以替代鱼粉蛋白胨作为轮枝链霉菌产TGase发酵培养基的氮源。对轮枝链霉菌SK4.001生物合成TGase的酶学性质进行了研究。研究发现,TGase的最适反应温度为35℃,最适反应pH为7.0。20℃到40℃之间,温度稳定性较好。TGase在pH 6.0-7.0之间比较稳定。添加各种常见的金属离子均会使TGase酶活有一定的损失,添加乙二胺四乙酸并不会使TGase失活。以苯甲基氧化碳酰-L-谷氨酰胺甘氨酸（CBZ-Gln-Gly）为底物,得到TGase对底物（CBZ-Gln-Gly）的Km值为53.88 mmol/L,对底物（CBZ-Gln-Gly）的Vmax为0.98μmol/mL·min。对轮枝链霉菌SK4.001生物合成TGase的机理进行研究。研究发现TGase先以酶原的形式表达,随后酶原经发酵液中的一些水解蛋白酶的作用下水解成具有活性的成熟酶。离子交换层析法（填料:Fractogel EMD SO3-）可以分离纯化酶原。中性蛋白酶酶解酶原,发现酶原在一定条件下可以水解成成熟酶,但随着加入的蛋白酶浓度增大,酶解时间增长,酶原被酶解的程度也增高,同时非特异性切割也得到加强,成熟酶也随即被水解。用CTAB处理发酵液可以提高酶活,但CTAB并不是直接作用于酶原,其提高酶活的机理还有待于进一步研究。利用神经网络理论对轮枝链霉菌SK4.001产TGase过程进行建模。研究发现,BP神经网络能够较好地对整个发酵过程进行模拟和预测,网络模拟的最大相对误差为4.76%,网络预测的最大相对误差在13.99%,为轮枝链霉菌SK4.001发酵产TGase在线测量和控制提供了参考。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 谷氨酰胺转胺酶概况
• 1.1.1 来源
• 1.1.2 酶学性质
• 1.1.3 晶体结构
• 1.1.4 反应机理
• 1.2 微生物法生物合成TGASE 国内外研究进展
• 1.2.1 国外研究进展
• 1.2.2 国内研究进展
• 1.2.3 小结
• 1.3 TGASE 的分离纯化
• 1.4 神经网络模型在发酵中的应用
• 1.5 TGASE 的应用
• 1.6 研究背景与立题意义
• 1.6.1 立题背景与意义
• 1.6.2 研究内容
• 第二章 豆饼粉酶解液对TGASE 酶活的影响
• 2.1 前言
• 2.2 材料与仪器
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 主要仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 豆饼粉酶解工艺
• 2.3.2 培养条件
• 2.3.3 蛋白质含量测定
• 2.3.4 蛋白酶酶活的测定
• 2.3.5 TGase 酶活测定
• 2.3.6 菌体干重测定
• 2.3.7 豆饼粉酶解用酶筛选实验
• 2.3.8 酶解液不同添加量对TGase 酶活的影响
• 2.3.9 胰蛋白酶酶解豆饼粉的单因素实验
• 2.3.10 最佳酶解条件的优化
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 蛋白酶酶活标准曲线的测定
• 2.4.2 蛋白含量标准曲线的测定
• 2.4.3 TGase 酶活标准曲线测定
• 2.4.4 氮源对TGase 酶活的影响
• 2.4.5 不同蛋白酶对豆饼粉水解度（DH）的影响
• 2.4.6 豆饼粉酶解液水解度的对TGase 酶活的影响
• 2.4.7 酶解液添加量对TGase 酶活的影响
• 2.4.8 胰蛋白酶水解豆饼粉的单因素实验
• 2.4.9 酶解条件的优化
• 2.4.10 验证实验
• 2.5 本章小结
• 第三章 TGASE 酶学性质的研究
• 3.1 前言
• 3.2 材料与仪器
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 主要仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 TGase 反应的最适温度
• 3.3.2 TGase 的温度稳定性
• 3.3.3 TGase 反应的最适pH 值
• 3.3.4 TGase 的pH 稳定性
• 3.3.5 金属离子对TGase 酶活的影响
• 3.3.6 EDTA 对TGase 酶活的影响
• 3.3.7 TGase 反应动力学常数测定
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 TGase 最适反应温度
• 3.4.2 温度对TGase 稳定性的影响
• 3.4.3 TGase 最适反应pH 值
• 3.4.4 pH 对TGase 稳定性的影响
• 3.4.5 不同金属离子对TGase 酶活的影响
• 3.4.6 TGase 反应动力学参数的确定
• 3.5 本章小结
• 第四章 STREPTOVERTICILLIUM SK4.001 产TGASE 机理初步探索
• 4.1 前言
• 4.2 材料与仪器
• 4.2.1 材料
• 4.2.2 主要仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 培养条件
• 4.3.2 菌体干重的测定
• 4.3.3 TGase 酶活的测定
• 4.3.4 残余甘油的测定
• 4.3.5 乙醇沉淀
• 4.3.6 离子交换层析
• 4.3.7 蛋白酶酶解酶原
• 4.3.8 CTAB 处理发酵液及酶原
• 4.3.9 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 4.4 结果及分析
• 4.4.1 发酵液中酶原存在的假设
• 4.4.2 酶及酶原分泌的时间进程
• 4.4.3 酶原的分离纯化
• 4.4.4 蛋白酶酶解酶原
• 4.4.5 CTAB 对发酵液中TGase 酶活及酶原的影响
• 4.5 本章小结
• 第五章 发酵动力学模型的建立
• 5.1 前言
• 5.2 材料与仪器
• 5.2.1 实验材料
• 5.2.2 实验仪器
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 培养方法
• 5.3.2 生物量测定方法
• 5.3.3 甘油测定方法
• 5.3.4 酶活测定方法
• 5.3.5 BP 神经网络模型
• 5.4 结果与分析
• 5.4.1 BP 神经网络模型建立
• 5.4.2 BP 神经网络拟合结果
• 5.4.3 BP 神经网络的验证与预测
• 5.5 本章小结
• 第六章 主要结论与展望
• 6.1 主要结论
• 6.2 进一步工作方向
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士期间发表的论文