论文摘要
前言喉癌是常见的头颈部恶性肿瘤,在世界范围内,喉癌的发病率居于全身恶性肿瘤的第十一位。目前,手术和放射治疗仍然是治疗喉癌的主要手段;化学治疗对局部控制率的提高和预后的改善作用尚需进一步的研究。在过去的几十年,随着各种喉功能保留措施的应用,喉全切除术的应用正在逐渐减少,但是喉癌的生存率没有大的提高。因此,进一步研究喉癌发生、发展的分子生物学机制,发现其肿瘤标志物及临床意义,对于喉癌的预防、诊断、预后评价和化疗药物选择将有重大的意义。信号转导和转录激活因子家族（signal transducers and activators oftranscription,STATs）于上世纪90年代在研究干扰素（IFNα和IFNγ）对细胞的作用机制时被发现,Stat3是STATs家族的重要成员。Stat3蛋白在细胞质中呈潜伏状态,通过酪氨酸磷酸化被激活,磷酸化Stat3形成同源或异源性二聚体,转运至细胞核,发挥促进转录的作用。在正常细胞,Stat3的激活是个短暂的过程,只持续数分钟至数小时。目前已经发现Stat3在人体多种原发肿瘤和细胞系中均有激活,并被定义为癌基因。Star3主要通过调节下游靶基因的表达来发挥作用,包括肿瘤细胞生存、生长、血管生成、侵袭和逃避免疫监视等,其主要靶基因有Cyclin D1、Bcl-xL、c-Myc等。目前,头颈部鳞癌癌变的具体机制还不十分清楚,关于喉癌组织中Stat3表达和激活情况及与下游靶基因Cyclin D1的关系,国内外尚未见专题报道。目的为了明确喉癌组织中Stat3表达和激活情况、活化的Stat3与其靶基因CyclinD1表达关系和活化的Stat3相关临床病理因素。材料与方法一、实验材料收集2005年1月至2005年6月之间中国医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科64例喉癌手术标本。对照组:选取其中的12例喉全切除术标本中,距离肿瘤边缘＞1.0cm的粘膜组织作为对照组。二、实验方法（一）RT-PCR检测Stat3和Cyclin D1 mRNA表达Trizol一步法提取总RNA。cDNA合成后进行PCR扩增Star3基因引物序列为:5′-GGCATTCGGAAAGTATTG-3′（上游）,5′-TCACCCACATTCACTCATT-3′（下游）,扩增长度463bp;Cyclin D1基因引物序列为:5′-CCCACTCCTACGATACGC-3′（上游）,5′-AGCCTCCCAAACACCC-3′（下游）,扩增长度378bp;β-actin引物序列为:5′-AAATCGTGCGTGACATTAA-3′（上游）,5′-CTCGTCATACTCCTGCTTG-3′（下游）,扩增长度473bp。（二）Western印迹检测Stat3、p-Stat3和Cyclin D1蛋白表达取组织块提取细胞总蛋白,10%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,转印后用Stat3、p-Stat3、Cyclin D1和抗β-actin单克隆抗体孵育。加入用碱性磷酸酶标记的相应二抗,显色后置于UVP-8000凝胶成像仪成像。（三）免疫组化检测Stat3、p-Stat3和Cyclin D1蛋白表达采用链霉菌抗生物素蛋白—过氧化酶连接（SP）免疫组织化学方法,实验步骤按试剂盒说明书进行。（四）统计学分析应用SPSS 11.5软件进行统计分析。计量资料采用均数±标准差（x±s）表示,两组均数比较时用独立样本t检验;计数资料采用x2检验;双变量相关性分析采用Pearson相关分析。结果1、64例喉癌组织和12例对照组织中均有Stat3 mRNA的表达。喉癌组织与对照组织中Stat3 mRNA表达值分别为69.49±10.78和33.24±2.89,二者之间差异具有统计学意义（t=11.518,P=0.000）。2、Western印迹64例喉癌组织和12例对照组织中均有Stat3蛋白的表达,喉癌组织与对照组织中Stat3蛋白表达值分别为118.83±25.86和72.46±6.58,二者之间差异具有统计学意义（t=6.142,P=0.000）。3、免疫组化Stat3蛋白细胞质和细胞核均有着色;64例癌组织中阳性67.2%,其中弱阳性21.9%,中度阳性20.3%,强阳性25.0%;12例对照粘膜组织均为阴性;二者之间差异具有统计学义（x2=18.568,P=0.000）。4、Western印迹64例喉癌组织和12例对照组织中均有p-Stat3蛋白的表达,喉癌组织与对照组织中p-Star3蛋白表达值分别为61.89±18.80和13.65±2.62,二者之间差异具有统计学意义（t=8.821,P=0.000）。5、免疫组化p-Stat3蛋白细胞核着色;64例癌组织中阳性48.4%,其中弱阳性23.4%,中度阳性17.2%,强阳性7.8%;12例对照粘膜组织均为阴性;二者之间差异具有统计学意义（x2=9.817,P=0.002）。6、不同性别、年龄、组织分化程度、肿瘤主体部位p-Stat3蛋白水平无显著性差异;临床T1、T2病变的p-Stat3蛋白水平高于临床T3、T4病变。7、64例喉癌组织和12例对照组织中均有Cyclin D1 mRNA的表达。喉癌组织与对照组织中Cyclin D1 mRNA表达值分别为73.67±17.16和31.43±3.31,二者之间差异具有统计学意义（t=8.454,P=0.000）。8、Western印迹64例喉癌组织和12例对照组织中均有Cyclin D1蛋白的表达,Cyclin D1蛋白表达值分别为113.12±23.65和55.32±7.55,二者之间差异具有统计学意义（t=8.343,P=0.000）。9、免疫组化Cyclin D1蛋白细胞核着色;64例癌组织中阳性43.7%,其中弱阳性25.0%,中度阳性15.6%,强阳性3.1%;12例对照粘膜组织中阴性91.7%,弱阳性8.3%;二者之间差异具有统计学意义（x2=5.371,P=0.020）。10、Cyclin D1 mRNA与p-Star3蛋白正相关,Pearson相关系数为0.827,显著性检验P=0.000。结论1、喉癌组织中存在Star3 mRNA和蛋白的高表达。2、喉癌组织中存在Stat3的持续激活。3、喉癌组织中Star3在早期病变中活化水平高。4、喉癌组织中活化的Stat3可能通过促进下游靶基因Cyclin D1的转录来发挥作用。