STAT1/3信号通路参与了白细胞介素10/22和NKT细胞对小鼠大部肝切除后肝再生的影响

论文摘要

肝脏是在人体内是唯一的具有强大再生能力的实质性内脏器官。当肝组织受损伤时,已经分化成熟的肝细胞可以从静止期重新进入细胞周期进行分化,直到肝脏完全恢复至原有大小。三分之二肝脏切除（partial hepatectomy, PHx）模型是研究肝再生最常使用的动物模型。肝再生过程需一系列的调节细胞周期的通路参与,这些信号通路能与细胞周期改变保持高度协调一致,直至肝脏大小和功能完全恢复。PHx后,成熟的肝细胞首先重新进入细胞周期,完成DNA的复制分裂后进行12轮的细胞分裂,在术后24小时开始增殖,增殖峰值出现在术后的3642小时（hour, h）之间。一般来说PHx后肝脏的完全恢复在人类需要34个月,在啮齿类动物中只要7到10天（day, d）。大量的研究证据表明各类细胞因子、生长因子、激素和他们的下游信号通路参与了肝再生的病理生理过程。普遍的观点认为:PHx术后,残余肝脏对内毒素（LPS）的清除能力大大降低,LPS刺激枯否细胞产生炎症细胞因子肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素6（interleukin 6, IL-6）,从而启动肝再生的发生。PHx后短时间内一过性的低强度的炎症被认为是肝再生发生的初期阶段。促炎细胞因子TNF-α和其下游的信号分子NF-kB可通过诱导IL-6在早期的刺激肝细胞增殖阶段扮演了重要的角色。IL-6的作用是通过IL-6与其肝细胞上的受体IL-6受体复合物（gp80/gp130）相结合,随之激活信号转导子及转录激活子3（signal transducer and activator of transcription 3, STAT3）促进肝细胞的存活和增殖。文献报导在PHx后24h内的炎症反应和细胞因子的产生是肝细胞从静止状态进入细胞周期的重要原因。然而,如何控制炎症反应处于一定程度仍不甚了解。在本课题研究中,我们首先发现了抗炎细胞因子IL-10是肝再生中炎症的重要调控因子,可通过减少炎性细胞因子的产生进而抑制肝脏STAT3的激活参与肝再生的调控。此外,我们还研究发现了IL-10家族的另外一个细胞因子,白细胞介素22（interleukin 22, IL-22）在PHx后肝再生亦发挥重要作用。机制研究发现IL-22可通过激活STAT3通路从而促进肝细胞增殖。研究发现肝细胞IL-6/STAT3通路在PHx后肝再生中可促进肝细胞存活和增殖;反之,γ干扰素/信号转导子及转录激活子1（interferonγ/signal transducer and activator of transcription 1, IFN-γ/STAT1）通路在肝再生中发挥抑制作用。自然杀伤T细胞（Natural killer T, NKT）是一类同时具有自然杀伤细胞（natural killer cells, NK）和T细胞标记物和功能特征的细胞。肝淋巴细胞中具有大量的NKT细胞,小鼠肝脏NKT细胞占肝淋巴细胞总数的2035%,人类肝脏NKT细胞约占肝淋巴细胞总数1015%。研究表明NKT细胞可通过分泌不同种类的细胞因子,特别是大量产生的IFN-γ,在天然免疫和获得性免疫中发挥重要的调节作用。因此,有理由推测激活的NKT细胞可通过产生IFN-γ发挥抑制肝再生的作用。然而,激活的NKT细胞（Ι或者II型NKT细胞）在肝再生的确切作用仍然存在争议,不甚清楚。本研究的第三部分我们发现激活Ι型NKT细胞可通过IFN-γ/STAT1通路抑制PHx后的肝再生,而激活II型NKT细胞则发挥次要的抑制作用。研究目的1.研究IL-10在PHx后肝再生中作用2.研究IL-22在PHx后肝再生中作用3.研究激活的NKT细胞在PHx后肝再生中作用方法1.应用了多种不同类型的转基因和基因敲除小鼠。2. BrdU掺入法检测肝细胞增殖反应。3. FACS法检测炎性细胞因子。4. Real-time PCR法检测炎性细胞因子mRNA水平。5. Western blot法检测STAT1/3信号通路的表达6.免疫组化法和FACS法分别检测肝脏炎细胞浸润。结果1. IL-10 KO小鼠PHx后表现为升高的肝再生能力,其机制与增强的炎症反应和激活的肝细胞STAT3有关PHx后,IL-10mRNA在肝脏和脾脏内的表达显著升高,IL-10mRNA在PHx后的诱导部分依赖于TLR4通路。与野生型（wild-type , WT）小鼠比较,PHx后IL-10 KO小鼠肝脏表现为更高mRNA水平的炎性细胞因子（IL-6, TNF-α和IFN-γ）和炎细胞标记物（CCR2和F4/80）,同时,血清和肝脏蛋白水平的炎症细胞因子亦升高;免疫组化和FACS结果显示PHx后IL-10 KO小鼠肝脏表现为更多的炎性细胞（巨噬细胞和中性粒细胞）浸润。BrdU掺入法结果发现PHx后IL-10 KO小鼠表现为升高的肝细胞增殖反应,其作用与激活的肝脏STAT3通路有关,进一步敲除肝细胞上STAT3蛋白可逆转升高的IL-10 KO小鼠肝再生能力。2. PHx后IL-22转基因（IL-22TG）小鼠具有加速的肝再生,而IL-22 KO小鼠PHx后肝再生无明显改变PHx后,WT小鼠和IL-22 KO小鼠的肝再生水平无显著差异。随后,我们考察了肝组织特异性的高表达IL-22对PHx后肝再生的影响。结果发现PHx 0h IL-22TG和WT小鼠的肝重/体重比值无明显差异,而PHx后3272h IL-22TG小鼠明显高于WT小鼠,96h后两者无显著差异。BrdU掺入实验表明PHx后IL-22 TG小鼠具有加速的肝再生。为了进一步探讨IL-22促进PHx后肝再生的机制,我们采用Western blot方法检测了IL-22 TG和WT小鼠PHx后STAT3和STAT1通路的改变。结果发现高表达的pSTAT3和细胞周期蛋白D1是导致IL-22TG肝再生增加的原因。3.激活Ι型NKT细胞可通过IFN-γ/STAT1信号通路抑制PHx肝再生,II型NKT细胞在抑制肝再生作用中发挥次要作用注射α-GalCer和Sulfatide分别激活Ⅰ型和II型NKT细胞均可显著抑制肝再生。抑制作用以手术同时α-GalCer注射和术前3天注射最为明显,注射Sulfatide亦可抑制肝再生,但抑制程度不如α-GalCer。进一步的研究发现,α-GalCer可激活PHx后IFN-γ/STAT1通路,阻断IFN-γ或者STAT1基因可消除这种抑制作用。结论1. IL-10通过限制炎症反应和随后的STAT3通路负向调节PHx肝再生。2.肝脏高表达的IL-22可通过刺激肝脏STAT3通路促进肝再生。3.激活的NKT细胞可抑制PHx后肝再生,其作用依赖于IFN-γ/STAT1信号通路。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 一、前言
• 二、材料与方法
• 1 实验材料
• 1.1 动物
• 1.2 药物与试剂
• 1.3 仪器与设备
• 2 实验方法
• 2.1 小鼠70%肝切除模型的建立
• 2.2 小鼠肝脏再生率的检测
• 2.3 小鼠肝脏H&E 染色
• 2.4 免疫组织化学染色
• 2.5 肝脏中 RNA 的抽提及相关基因表达水平的定量RT-PCR 检测
• 2.6 蛋白免疫印迹（Western blot）
• 2.7 清和肝脏中细胞因子水平检测
• 2.8 肝脏淋巴细胞流式细胞分析
• 2.9 统计学处理
• 3 结果
• 3.1 PHx 后肝脏和脾脏炎症细胞因子表达增加
• 3.2 PHx 后IL-10 上调部分依赖于 TLR4 信号通路
• 3.3 IL-10 抑制PHx 术后的炎症反应
• 3.3.1 IL-10 mRNA 水平上抑制 PHx 术后的炎症反应
• 3.3.2 IL-10 在蛋白质水平上抑制PHx 术后的炎症反应
• 3.3.3 IL-10抑制 PHx术后的不同炎症细胞数目和百分比的影响
• 3.3.4 IL-10 对PHx 术后的肝脏炎症病灶数目、中性粒细胞和巨噬细胞的影响
• 3.3.5 IL-10 对 PHx 术后血清细胞因子的影响
• 3.4 IL-10 抑制 PHx 后肝脏再生能力
• 3.4.1 IL-10 对 PHx 后小鼠生存率、肝脏指数和肝脏病理的影响
• 3.4.2 IL-10 抑制 PHx 后小鼠肝细胞增殖
• 3.5 IL-10 抑制 PHx 后肝再生的机制
• 3.5.1 过度激活的肝脏 STAT3 通路是 IL-10 KO 小鼠 PHx 后肝再生升高的机制之
• 3.5.2 进一步肝细胞特异性阻断 STAT3 通路可逆转 IL-10 K0 小鼠 PHx 后增强的肝再生能力
• 3.6 IL-22 对 PHx 后肝再生的影响
• 3.6.1 IL-22 基因敲除对 PHx 引起的肝再生无影响
• 3.6.2 肝细胞特异性 IL-22 高表达可促进 PHx 引起的肝再生
• 3.7 激活 NKT 细胞释放 IFN-γ抑制 PHx 引起的肝再生
• 3.7.1 NKT 细胞激活后 PHx 后对小鼠生存率和肝脏病理的影响
• 3.7.2 激活 NKT 细胞对小鼠 PHx 后肝再生的影响
• 3.7.3 激活 NKT 细胞抑制小鼠 PHx 后肝再生的机制
• 4 小结
• 4 1 IL-10 参与了 PHx 后肝再生的病理生理机制
• 4.2 IL-22 可促进 PHx 后肝再生
• 4.3 激活 NKT细胞后可通过IFN—γ／sTAT1通路抑制PHx肝再生
• 三、讨论
• 1. IL-10 可抑制 PHx 后的肝脏炎症反应和肝再生
• 2. IL-22 的肝保护以及促肝再生作用
• 3. IFN-γ/STAT1通路参与了NKT细胞的肝再生抑制作用
• 四、结论
• 五、本研究的不足及今后工作展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 综述：To11 样受体3 在肝脏疾病中的作用
• 参考文献