黑曲霉基因阻断突变菌株的构建及其功能分析

论文摘要

黑曲霉（Aspergillus niger）是生产葡糖淀粉酶、（半）纤维素酶、植酸酶等多种酶制剂和有机酸如柠檬酸等的重要工业微生物。由于它具有胞外蛋白高分泌性能、与高等真核生物类似的翻译后加工能力、成熟的发酵工艺和安全性等优点,而成为基因工程中新一代微生物表达分泌系统,是生产价值昂贵医药产品的最有发展前景的基因工程宿主菌之一。但由于黑曲霉自身蛋白酶活性较高,使外源蛋白遭受降解而导致产量不高,尽管通过生产中的工艺措施如降低温度,提高pH.产物与蛋白质产品早期分离以及添加蛋白酶抑制剂等可以减少目的蛋白质的降解,但仍不能有效地解决外源蛋白质的降解问题。构建蛋白酶缺陷菌株被认为是目前提高外源基因表达水平最重要的策略之一。 为改进黑曲霉对外源蛋白的表达分泌,本文采用同源重组的方法,分别使编码胞外碱性蛋白酶的pepD基因、胞外酸性蛋白酶pepAd基因和内质网蛋白质降解途径相关基因derl阻断,并初步研究了这三个基因对外源蛋白漆酶表达分泌的影响。 本研究的主要结果如下: 1.运用同源重组技术破坏了黑曲霉基因组中的pepD基因,该基因编码一种类subtilisin的胞外蛋白酶PEPD。实验以黑曲霉GICC2773基因组DNA为模板,PCR扩增pepD基因2317bp的片段,将此基因片段与pBS-T载体连接,并在此基因中间BstB Ⅰ位点插入潮霉素抗性基因（hph）表达单元,构建成pepD基因阻断重组质粒pBSDH,用Stu Ⅰ酶切,由此产生了3.7kb的pepD基因阻断线性片段。采用原生质体PEG/CaCl2法将酶切阻断质粒pBSDH得到的含pepD基因和hph表达单元的3.7kb线性片段转化Aspergillus niger GICC2773菌株,在含潮霉素的平板上筛选到84个潮霉素抗性转化子,从这些抗性转化子中经PCR检测分离到1个pepD基因阻断突变菌株△pepD66。外源漆酶分泌活性分析显示,黑曲霉pepD基因的破坏使其外源漆酶的分泌表达有所提高。 2.以Aspergillus niger GICC2773基因组DNA为模板,用PCR方法扩增pepAd基因2157bp的DNA序列,将此基因片段与pBS-T载体连接,在此基因中间Aau Ⅰ位点插入潮霉素抗性基

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 丝状真菌外源基因表达分泌系统的特点
• 1.2 丝状真菌遗传转化系统研究进展
• 1.3 影响丝状真菌外源蛋白产量的因素
• 1.4 真菌蛋白分泌途径
• 1.5 提高外源蛋白产量的对策
• 第二章 引言
• 2.1 研究的目的和意义
• 2.2 主要的技术路线
• 第三章 黑曲霉pepD基因阻断突变菌株的构建及其功能分析
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 pepD基因的PCR合成
• 3.3.2 pepD基因阻断质粒的构建
• 3.3.3 黑曲霉转化及pepD基因阻断株的筛选
• 3.3.4 pepD基因阻断的核苷酸序列证据
• 3.3.5 黑曲霉pepD基因阻断对蛋白质表达分泌的影响
• 第四章 黑曲霉pepAd基因阻断菌株的构建及其功能分析
• 4.1 材料
• 4.2 方法
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 pepAd基因阻断质粒的构建
• 4.3.2 黑曲霉转化及pepAd基因阻断株的筛选
• 4.3.3 pepAd基因阻断的核苷酸序列证据
• 4.3.4 黑曲霉pepAd基因阻断对外源蛋白漆酶（laccase）的表达分泌的影响
• 第五章 黑曲霉derl基因阻断突变菌株的构建及其功能分析
• 5.1 材料
• 5.2 方法
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 derl基因P端和T端同源片段的PCR扩增
• 5.3.2 derl基因阻断质粒的构建
• 5.3.3 黑曲霉derl基因阻断菌株的筛选及PCR检测
• 5.3.4 derl基因阻断的核苷酸序列证据
• 5.3.5 黑曲霉derl基因阻断对蛋白表达分泌的影响
• 5.3.6 derl基因的克隆表达
• 第六章 讨论
• 参考文献
• 主要缩略词表
• 在读期间发表论文情况
• 致谢