扁座壳孢菌蛋白酶的纯化及性质研究

论文摘要

座壳孢是一种重要的的虫生真菌,在其侵染害虫过程中产生的蛋白酶是重要毒力因子。基于形态特征WYSD-16被鉴定为扁座壳孢,以WYSD-16为试验材料,先通过单因素的粗筛和正交实验设计优化的方法,获得对座壳孢菌产酶条件优化的培养基。采用单因素筛选法研究碳源、氮源以及维生素对产酶量的影响,结果表明麦芽糖、蛋白胨、Mg2+、VB6分别为最适合该菌产酶的碳源、氮源、金属离子和维生素。通过对碳源、氮源、维生素等其他因素的正交优化得出该菌最佳产酶培养基:40g/L的麦芽糖,20g/L的蛋白胨,4×10-4mol/L Mg2+,400mg/L的VB6,pH 6.0;最佳产酶条件为:接菌量8ml,装液量150ml/250ml,菌龄5d,培养时间10d。座壳孢菌利用优化后的产酶培养基培养10d后,蛋白酶活达到73.18 U/mL。采用硫酸铵沉淀、DEAE-52离子交换柱层析、Sephadex G-100柱层析等步骤获得了凝胶电泳均一的蛋白酶,经SDS-PAGE电泳验证表明酶蛋白的分子量约为66 kDa。该酶水解酪蛋白的最适温度为50℃,最适pH值为8.0;Na+、乙醇对酶活都有较大的促进作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 座壳孢的应用
• 1.2 粉虱座壳孢菌研究与应用
• 1.3 扁座壳孢的研究现状
• 1.4 虫生真菌蛋白酶
• 2 菌株WYSD-16的鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 试剂及工具
• 2.1.3 切片
• 2.1.4 制片
• 2.2 结果
• 2.3 分析
• 3 座壳孢菌产酶培养基和培养条件的筛选
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌株和培养基
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 仪器
• 3.1.4 蛋白酶活力的测定方法
• 3.1.5 蛋白质的定量测定-考马斯亮蓝染色法
• 3.1.6 蛋白酶产酶条件研究
• 3.2 结果
• 3.2.1 酪氨酸标准曲线
• 3.2.2 蛋白含量标准曲线
• 3.2.3 蛋白酶产酶培养基和条件研究
• 3.3 分析
• 4 蛋白酶的纯化
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 粗酶液的制备
• 4.1.2 硫酸铵分级沉淀
• 4.1.3 透析
• 4.1.4 浓缩
• 4.1.5 DEAEA-52离子交换层析
• 4.1.6 SephadexG-100层析柱
• 4.1.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 4.2 结果
• 4.3 分析
• 5 酶学性质研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 温度对酶活性及热稳定性的影响
• 5.1.2 pH对酶活性及酸碱稳定性的影响
• 5.1.3 金属离子对酶活性的影响
• 5.1.4 有机溶剂对酶活性的影响
• 5.2 结果
• 5.2.1 温度对酶活性及热稳定性的影响
• 5.2.2 pH对酶活性及酸碱稳定性的影响
• 5.2.3 金属离子对酶活性的影响
• 5.2.4 有机溶剂对酶活性的影响
• 5.3 分析
• 6 小结
• 参考文献
• 附录
• 致谢