蛛丝蛋白工程菌pNS2/BL21（DE3）发酵工艺和纯化方法的优化及表达产物的组织相容性研究

论文摘要

蜘蛛的拖丝是一种既具有抗张强度又具有高度弹性的奇特蛋白质纤维，作为生物材料具有广泛的应用前景，基因工程技术为大规模生产重组蛛丝蛋白提供了可能途径。本研究论文在本室前期工作的基础上，探讨了基因重组蛛丝蛋白工程菌pNS2／BL21（DE3）的高密度发酵工艺和重组蛛丝蛋白的纯化工艺，将所获得的重组蛛丝蛋白制得蛛丝蛋白支架材料，体外植入实验证实了蛛丝蛋白支架材料的生物相容性。采用正交实验设计法，首次对蛛丝蛋白工程菌pNS2／BL21（DE3）高密度发酵条件进行了优化，蛛丝蛋白基因工程菌要获得较高表达水平的条件综合为：诱导pH7.0、温度32℃、0.1％（w／v）的Gly／Ala浓度和0.2mmol／LIPTG。重复验证实验表明：菌体最终OD值为55～60，目的蛋白占总蛋白的表达量为22～24％。优化了蛛丝蛋白规模纯化方法，建立了重组蛛丝蛋白简单、高效的规模纯化工艺。优化的方案将加热温度提高而且延长加热时间，在除杂效果上大大优于原纯化方法。通过提高纯化效率和蛋白得率，最终纯化的重组蛛丝蛋白纯度可达85％以上，得率达10mg／g菌体，是原方法的3倍，而时间缩短了一半。探讨了重组蛛丝蛋白材料的体内植入大鼠实验，比较了pNS2蛛丝蛋白、pNSR16蛛丝蛋白、PVA以及pNSR-Z蛋白四种材料的组织相容性，其优劣顺序为pNSR16＞pNS2＞PVA＞pNSR-Z。pNSR16和pNS2支架材料均显示出良好的组织相容性，其应用于组织工程的前景是广阔的。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 中文文摘
• 第1章 绪论
• 1.1 蜘蛛丝的研究概况
• 1.1.1 蜘蛛丝的特性
• 1.1.1.1 蜘蛛丝的理化性质
• 1.1.1.2 蜘蛛丝的结构与力学性能
• 1.1.2 蛛丝蛋白的基因工程
• 1.1.2.1 不同宿主表达蛛丝蛋白
• 1.1.2.2 国内蛛丝蛋白基因研究
• 1.1.3 蜘蛛丝的应用前景
• 1.1.3.1 人造皮肤
• 1.1.3.2 人工肌腱
• 1.1.3.3 军事及民用防护领域
• 1.2 基因工程大肠杆菌高密度培养
• 1.2.1 影响大肠杆菌高密度发酵的主要因素
• 1.2.1.1 宿主菌
• 1.2.1.2 质粒载体
• 1.2.1.3 高密度培养条件
• 1.3 基因重组蛋白纯化研究进展
• 1.3.1 表达系统
• 1.3.1.1 表达系统的类型
• 1.3.1.2 包涵体的处理
• 1.3.2 主要分离纯化方法
• 1.3.2.1 样品准备与预处理
• 1.3.2.2 层析技术
• 1.3.2.3 其他方法
• 1.4 组织工程生物材料
• 1.4.1 生物材料及生物相容性的概念
• 1.4.2 应用于组织工程相关材料概况
• 1.4.2.1 人工合成可降解聚合物
• 1.4.2.2 天然高分子聚合物
• 1.4.3 生物材料体内植入
• 1.4.4 蛛丝蛋白作为生物材料的应用前景
• 1.5 本研究的背景、主要内容及意义
• 1.5.1 本研究的背景材料
• 1.5.2 本研究的主要内容
• 1.5.3 本研究的意义
• 第2章 基因重组蛛丝蛋白工程菌pNS2/BL21（DE3）高密度发酵条件的优化
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株和重组质粒
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 仪器与设备
• 2.1.4 培养基与主要溶液
• 2.2 方法
• 2.2.1 pNS2/BL21（DE3）工程菌的重新转化
• 2.2.1.1 制备感受态细胞
• 2.2.1.2 pNS2重组质粒的小量制备
• 2.2.1.3 转化
• 2.2.1.4 新转化的pNS2/BL21（DE3）的摇瓶诱导表达筛选高活性菌株
• 2.2.2 蛛丝蛋白基因工程菌pNS2/BL21（DE3）的高密度发酵
• 2.2.2.1 种子液的制备
• 2.2.2.2 培养基与发酵罐的灭菌
• 2.2.2.3 发酵过程的控制
• 2.2.2.4 目的蛋白诱导表达
• 2.2.3 高密度发酵正交实验设计及方法
• 2.2.3.1 实验设计
• 2.2.3.2 实验方法
• 2.2.4 分析方法
• 2.2.4.1 菌体浓度
• 2.2.4.2 细胞湿重与干重测定
• 2.2.4.3 SDS-PAGE电泳
• 2.2.4.4 重组蛛丝蛋白表达含量的测定
• 2.3 结果
• 2.3.1 pNS2/BL21（DE3）的摇瓶诱导表达筛选高活性菌株
• 2.3.2 pNS2/BL21（DE3）高密度发酵正交实验
• 2.3.3 对基因工程菌表达蛋白的几个影响因素
• 2.3.3.1 前体物添加量的影响
• 2.3.3.2 IPTG浓度的影响
• 2.3.3.3 pH的影响
• 2.3.3.4 温度的影响
• 2.3.4 对发酵工艺条件的优化
• 2.3.4.1 同组次诱导表达水平
• 2.3.4.2 发酵工艺条件的确立
• 2.4 讨论
• 2.5 结论
• 第3章 基因重组蛛丝蛋白规模化纯化方法的优化
• 3.1 材料
• 3.1.1 主要试剂
• 3.1.2 主要仪器
• 3.1.3 常用溶液
• 3.2 方法
• 3.2.1 小量重组蛛丝蛋白纯化方法的优化
• 3.2.1.1 超声破碎细胞
• 3.2.1.2 加热对重组蛋白的影响
• 3.2.1.3 pH对重组蛋白的影响
• 3.2.1.4 硫酸铵饱和度对重组蛋白的影响
• 3.2.1.5 等电点pH对重组蛋白的影响
• 3.2.2 规模化重组蛛丝蛋白纯化方法的优化
• 3.2.2.1 超声破碎细胞
• 3.2.2.2 加热、调酸、调硫酸铵饱和度分离目的蛋白
• 3.2.2.3 目的蛋白透析与冻干
• 3.3 结果
• 3.3.1 小量重组蛛丝蛋白纯化方法的优化
• 3.3.1.1 超声破碎细胞
• 3.3.1.2 加热对重组蛋白的影响
• 3.3.1.3 pH对重组蛋白的影响
• 4）₂SO₄饱和度对重组蛋白的影响'>3.3.1.4 （NH₄）₂SO₄饱和度对重组蛋白的影响
• 3.3.1.5 调等电点目的蛋白的影响
• 3.3.2 规模化重组蛛丝蛋白纯化方法的优化
• 3.4 讨论
• 3.4.1 小量重组蛛丝蛋白纯化方法的优化
• 3.4.1.1 破碎方法
• 3.4.1.2 加热、pH、硫酸铵饱和度对重组蛋白纯化的优化
• 3.4.2 规模化重组蛛丝蛋白纯化方法的优化
• 3.4.3 新工艺关键步骤
• 3.5 结论
• 第4章 重组蛛丝蛋白支架材料的组织相容性研究
• 4.1 材料
• 4.1.1 主要材料
• 4.1.2 实验动物
• 4.1.3 主要仪器和器械
• 4.1.3.1 仪器
• 4.1.3.2 手术器械
• 4.1.4 主要试剂
• 4.1.4.1 支架制备试剂
• 4.1.4.2 植入手术试剂
• 4.1.4.3 HE染色试剂
• 4.2 方法
• 4.2.1 支架制备
• 4.2.2 植入前支架处理
• 4.2.3 创伤模型
• 4.2.4 组织学石蜡切片步骤
• 4.2.5 组织学石蜡染色
• 4.2.6 组织学评价
• 4.3 结果
• 4.3.1 支架制备
• 4.3.2 植入手术
• 4.3.3 术后大体观察
• 4.3.4 植入材料 HE染色结果
• 4.3.4.1 材料植入3天 HE染色结果
• 4.3.4.2 材料植入7天 HE染色结果
• 4.3.4.3 材料植入30天 HE染色结果
• 4.4 讨论
• 4.5 结论
• 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果
• 致谢
• 个人简历