紫花苜蓿抗褐斑病基因的ISSR、SRAP以及AFLP分子标记研究

论文摘要

苜蓿（Medicago sativa L.）是重要的蛋白饲料,被誉为“牧草之王”。由苜蓿假盘菌（Pseudopeziza medicaginis （Lib.） Sacc.）引起的褐斑病是苜蓿最常见和破坏性很大的病害之一。抗病新材料的选育和使用是防治苜蓿褐斑病最经济、有效的办法。本研究以五个品种苜蓿的抗、感株系,中抗×中抗组合,（抗×感）×感BC1群体为实验材料,利用BSA法结合ISSR、SRAP以及AFLP三种分子标记技术筛选与苜蓿抗褐斑病基因连锁的分子标记,旨在为苜蓿抗褐斑病种质材料的快速鉴定以及苜蓿抗褐斑病的分子标记辅助选择育种奠定基础,同时,也根据BC1群体抗、感单株的分离情况对苜蓿抗褐斑病遗传规律做探索性研究。本项研究取得的主要结果如下:1、通过优化影响紫花苜蓿（Medicago sativa. L）ISSR-PCR的主要参数,建立适于紫花苜蓿的ISSR反应体系和扩增程序。在20μL体系中各反应物的最适含量为:15 ng模板DNA,0.2 mmol/L dNTP,0.4μmol/L ISSR引物,0.8 U Taq DNA聚合酶,2μL 10×PCR Buffer,1.5 mmol/L MgCl2,2.5%去离子甲酰胺。PCR扩增程序为:94℃预变性4 min,94℃变性30 s,62℃（62℃～58℃）退火45 s,72℃延伸1 min 45 s,共11个循环,每个循环退火温度降1℃; 94℃变性30 s,52℃（52℃～48℃）退火45 s,72℃延伸1 min 45 s,共24个循环;72℃延伸5 min,25℃保温。2、用伊鲁瑰斯、萨兰斯、沙湾、沙河、泾阳五个品种苜蓿的抗、感株系分别建立各自的抗、感病DNA池,通过ISSR标记研究,得到与抗褐斑病基因相关的ISSR标记4个,分别为ISSR6-S640、ISSR22-S450、ISSR22-S660与ISSR834-R450。3、通过接种鉴定,在以上五个品种苜蓿的抗、感株系中,筛选出高抗单株6株,高感单株6株,中抗单株4株,通过相互间杂交,配置高抗×高抗组合6个,高感×高感组合6个,高抗×高感组合21个,中抗×中抗组合4个,对各组合后代进行接种鉴定,筛选出优良高抗×高抗组合2个,高感×高感组合2个,高抗×高感组合1个,中抗×中抗组合1个,将其作为进一步试验的研究材料或者作为苜蓿抗褐斑病育种的原始材料。4、以中抗×中抗群体为试验材料,通过SRAP标记研究,获得与抗褐斑病基因连锁的SRAP标记1个,命名为M3E3-R169,该标记与抗褐斑病基因间遗传距离为11.75 cM。经克隆测序,发现该标记片段中的6～157号碱基序列与紫花苜蓿谷氨酰胺合成酶基因的3855～4006号碱基具高度一致性,同一性高达97%,横跨该基因11号表达子与间隔子序列。5、对两个BC1群体进行接种鉴定,其抗、感单株分离比均符合为3:1的分离比例,结合高抗×高感F1群体多数为抗病单株的表现,初步推断苜蓿褐斑病为单显性基因控制,可能存在多个微效基因共同作用。6、对BC1群体进行AFLP标记分析,得到与褐斑病抗或感病基因连锁的分子标记三个,分别为M1P1-R206、M2P8-R185和M5P6-S264,其在群体抗、感单株中分子标记检测的正确率分别为91.2 %、89.2 %与95.7%,与抗病基因的遗传距离分别为8.95 cM、10.95 cM与4.35 cM。经对三个标记的克隆测序,发现三个片段均与截形苜蓿的一些克隆片段具有很高的同源性。本研究鉴定出的四个苜蓿抗褐斑病分子标记,将为苜蓿抗褐斑病种质资源的鉴定以及抗褐斑病育种提供分子标记辅助选择的依据,会提高选择效率,缩短育种年限。同时,本研究中所建立的BC1群体还可用于紫花苜蓿遗传图谱的构建。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 引言
• 1.1 分子标记的种类及其在植物遗传育种中的应用
• 1.1.1 分子标记的种类
• 1.1.2 DNA 分子标记在植物遗传育种中的应用
• 1.2 分子标记在苜蓿研究中的应用
• 1.2.1 分子标记在苜蓿种质鉴定及遗传多样性研究中的应用
• 1.2.2 分子标记在苜蓿连锁图谱构建中的应用
• 1.2.3 分子标记在苜蓿重要基因定位研究中的应用
• 1.3 苜蓿褐斑病研究进展
• 1.3.1 苜蓿褐斑病的分布与危害
• 1.3.3 苜蓿褐斑病抗性材料鉴定与筛选的研究进展
• 1.4 本项研究的目的和意义
• 第二章 苜蓿抗褐斑病基因的ISSR 标记研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 群体单株病情鉴定
• 2.2.2 ISSR 反应体系的优化
• 2.2.3 ISSR 标记筛选
• 2.2.4 抗、感以及中抗亲本遗传距离分析
• 2.3 讨论
• 2.3.1 抗、感池构建方法的探讨
• 2.3.2 ISSR 标记影响因素的探讨
• 2.3.3 亲本遗传距离与杂交组合配置的探讨
• 第三章 苜蓿抗褐斑病基因的SRAP 标记研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 杂交F1 代单株病情鉴定
• 3.2.2 SRAP 标记的筛选以及连锁分析
• 3.2.3 SRAP 标记的测序结果及序列分析
• 3.3 讨论
• 3.3.1 分离群体的选择
• 第四章 苜蓿抗褐斑病基因的AFLP 标记研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 BC1 群体病情鉴定
• 4.2.2 AFLP 标记的筛选
• 4.2.3 AFLP 标记的连锁分析
• 4.2.4 AFLP 标记的验证
• 4.2.5 AFLP 标记的测序结果及序列分析
• 4.3 讨论
• 4.3.1 苜蓿褐斑病抗性遗传规律的探讨
• 4.3.2 影响AFLP 标记的因素
• 4.3.3 ISSR、SRAP、AFLP 三种标记方法的比较
• 4.3.4 四个标记在分子标记辅助选择应用中的价值
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附录1-主要试剂配制
• 致谢
• 作者简历