玉米自交系Pb胁迫甲基化模式研究及抗氧化酶活性的测定

论文摘要

目前,重金属污染已经成为面积最大、危害最广的环境问题之一,而铅污染在重金属污染中排在第二位,严重影响着玉米等主要作物的生长发育和产量,进而威胁到人类的粮食安全和健康安全。因此,关于玉米对重金属响应机制的研究成为热点课题。本研究采用甲基化敏感扩增多态性（MSAP）技术,对铅胁迫抗性存在差异的玉米自交系178、郑58、S37不同胁迫浓度,及9782在不同铅胁迫浓度、不同时间段进行甲基化水平检测和分析;并对各材料胁迫后的甲基化变异位点和主要甲基化变异方式进行分析,及对特异片段的生物学功能进行分析,以了解参与的抗胁迫途径的主要DNA甲基化位点。另外,对9782、郑58、S37不同浓度铅胁迫浓度、不同胁迫时间的样品的抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性进行测定和分析。主要研究结果如下：1盆栽试验中,铅胁迫后不同品种玉米成熟期的甲基化整体水平为18.36-32.37%,水培试验中检测到的结果为21.31-27.53%。各对照中,检测到的甲基化水平平均为22.7%,与其他研究人员在玉米中得到的结果基本吻合。2胁迫后,大多数甲基化位点能维持其甲基化状态,本研究中检测到甲基化变异的最大值仅为25.67%。而半甲基化水平表现为显著的变化,如9782中最大的变化为48小时处理3比对照下降了46%。本研究表明,半甲基化位点由于自身的不稳定性,成为植物胁迫响应的主要甲基化位点。3胁迫以后较高甲基化水平的保持,与植物抗性的增强有一定的关系。抗性较好的材料178的甲基化水平显著高于郑58和S37。抗性高的材料其胁迫响应趋向于发生重新甲基化,抗性低的材料更趋向于发生去甲基化。因此,我们推测不同抗性材料胁迫响应途径不同。49782的根系和叶片的MSAP分析数据的规律比较一致,这说明同一材料各组织在胁迫响应中的反应方式基本一致。而且由于根系中受到胁迫压力较大,去甲基化作用体现得更加明显。因此,我们认为植物的不同组织和器官响应胁迫的甲基化变异方式基本是一致的,植物响应胁迫的方式是由植物自身的基因型所决定的。5将检测到的特异片段进行回收、测序,与玉米基因组文库进行同源性比对。预测同源片段功能结果表明,它们大多参与细胞的抗氧化代谢途径,以及细胞间的信号转导途径,或者作为某些转录因子参与一些蛋白、激素的合成。这说明DNA甲基化广泛参与了植物抗胁迫途径,是植物响应胁迫的重要手段之一。6胁迫后各材料抗氧化酶的各项指标均出现了显著的变化,POD和CAT均表现为先升高后降低,SOD为先大幅度下降,再略微下降。这说明植物体内这几种酶对环境变化非常敏感,是植物清除自由基的有效方式。而材料间的活性水平差异也比较明显,9782的整体表现最好,郑58次之,S37最差。这对于我们以后的抗性研究,有重要的指导意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1. 文献综述
• 1.1 重金属铅的来源及对人体的危害
• 1.1.1 土壤重金属铅的污染现状与粮食安全问题
• 1.1.2 作物育种手段在植物抗重金属研究中的运用
• 1.2 DNA甲基化
• 1.2.1 DNA甲基化酶
• 1.2.2 DNA甲基化的检测方法
• 1.2.3 DNA甲基化的生物学功能
• 1.2.4 重金属胁迫对作物DNA的损伤及与甲基化的关系
• 1.2.5 DNA甲基化在抗胁迫育种中的相关研究
• 1.3 胁迫对植物体内抗氧化酶的影响
• 2 实验目的意义
• 3 材料与方法
• 3.1 实验材料及设计
• 3.1.1 实验1材料与设计
• 3.1.1.1 实验材料
• 3.1.1.2 供试土壤背景
• 3.1.1.3 盆栽试验设计
• 3.1.1.4 样品采集
• 3.1.2 实验2材料与设计
• 3.1.2.1 实验材料
• 3.1.2.2 水培实验处理
• 3.1.2.3 样品采集
• 3.1.3 实验3材料与设计
• 3.1.3.1 实验材料
• 3.1.3.2 水培实验设计
• 3.1.3.3 样品采集
• 3.2 主要实验方法
• 3.2.1 DNA提取
• 3.2.1.1 试剂与溶液
• 3.2.1.2 DNA提取
• 3.2.2 MSAP实验方法
• 3.2.2.1 所需试剂
• 3.2.2.2 MSAP
• 3.2.2.3 PCR扩增产物检测（PAGE）
• 3.2.3 特异性片段回收、克隆与测序
• 3.2.3.1 回收
• 3.2.3.2 克隆
• 3.2.3.3 测序及同源性探寻
• 3.2.4 抗氧化酶活性测定
• 3.2.4.1 试剂与各提取缓冲液配置
• 3.2.4.2 总酶液的提取
• 3.2.4.3 POD活性的测定
• 3.2.4.4 CAT活性的测定
• 3.2.4.5 CAT活,性的测定
• 3.3 实验数据处理及分析
• 3.3.1 MSAP数据分析
• 3.3.1.1 各条带代表意义及统计原则
• 3.3.1.2 MSAP统计各项数据计算公式及代表意义
• 3.3.2 SOD、POD、CAT数据处理与计算公式
• 3.3.2.1 SOD活性计算公式
• 3.3.2.2 POD活性计算公式
• 3.3.2.3 CAT活性计算公式
• 4. 结果与分析
• 4.1 MSAP相关图片
• 4.1.1 DNA质量检测（1%琼脂糖凝胶电泳）
• 4.1.2 酶切检测（1%琼脂糖凝胶电泳）
• 4.1.3 预扩增检测（2%琼脂糖凝胶电泳）
• 4.1.4 选择性扩增（3%琼脂糖凝胶、6%PAGE电泳）
• 4.2 盆栽实验MSAP多态性扩增结果
• 4.2.1 各材料铅胁迫后DNA甲基化水平变化
• 4.2.2 各材料胁迫后甲基化类型变异情况
• 4.2.3 CCGG位点甲基化模式的变异分析
• 4.3 9782铅胁迫后MSAP多态性分析结果
• 4.3.1 根系中DNA甲基化多态性统计结果
• 4.3.2 9782根系随处理浓度变化的甲基化变化趋势
• 4.3.3 9782根系各处理的DNA甲基化水平随时间变化趋势
• 4.3.4 9782根系中各种甲基化变异类型
• 4.4 9782叶片中MSAP扩增结果与分析
• 4.4.1 MSAP统计结果与分析
• 4.4.2 9782随处理浓度变化叶片的甲基化变化趋势
• 4.4.3 各材料的DNA甲基化水平随时间变化趋势
• 4.4.4 各种带型及变异统计结果与分析
• 4.5 9782根系与叶片中甲基化状态的比较
• 4.6 差异片段回收、测序及序列分析结果
• 4.7 抗氧化酶活性测定
• 4.7.1 SOD指标检测结果
• 4.7.2 POD活性测定结果
• 4.7.3 CAT活性测定结果
• 4.7.4 对三个指标的综合评定
• 5 讨论
• 5.1 植物抗胁迫研究的意义
• 5.2 玉米基因组甲基化水平与抗性的关系
• 5.2.1 玉米在CCGG位点胞嘧啶甲基化的相对水平
• 5.2.2 不同材料在胁迫后的甲基化变异水平
• 5.2.3 胁迫后不同组织器官甲基化水平变化
• 5.2.4 胁迫后发生甲基化变异的序列分析
• 5.3 铅胁迫对玉米体内抗氧化系统的影响
• 6 结论
• 参考文献
• 致谢