青霉素G酰化酶DNA家族混组提高合成/水解比的研究

论文摘要

β-内酰胺类抗生素及其衍生物的工业化生产正在发生重大变革,传统化学转化法正在逐步被酶催化法所取代。青霉素G酰化酶（penicillin G acylase or penicillin G amidase,E.C.3.5.1.11,简称PGA或PAC）是半合成β-内酰胺类抗生素工业的重要用酶,主要用于水斛青霉素或头孢菌素分别生成母核6-APA（6-氨基青霉烷酸）或7-ADCA（7-氨基头孢烷酸）。PGA又可催化6-APA或7-ADCA与不同侧链酰基供体反应生成新的抗生素。PGA催化半合成β-内酰胺类抗生素是一种动力学控制的反应。动力学控制的PGA催化的合成反应面临的主要障碍是伴随着的水解反应,因此,合成/水解比常作为合成过程有效性的指标。提高S/H比是获得较高抗生素产量减少水解的有效手段。本研究运用DNA家族混组技术定向进化PGA,提高PGA参与合成反应的S/H比。试验结果如下: 本文通过PCR将HisTag与PGA融合,在具有T7启动子的pET-24a（+）质粒载体中进行表达,建立了一个通过的PGA表达和纯化方法,发酵获得的粗酶经Co2+-IDA琼脂载体一步纯化。四种重组野生型PGA（AfPGA、EcPGA、KcPGA、PrPGA）一步纯化收率分别为27.6%、36.3%、33.6%、19.7%;纯化倍数分别为40、183、107、17。对得到的四种重组PGA测定其参与7-ADCA和D-苯甘酰胺合成头孢氨苄反应的S/H.分别为2.5、13、17、3.3。 采用稀有酶处理五种青霉素G酰化酶基因（A.faecalis、B.megaterium、Ecoli、K. citrophila、P.rettgeri PGAs）进行DNA家族混组得到嵌合体基因α亚基嵌合子库。在KcPGA 基因的1054位（在α亚基和连接肽后）进行沉默突变引入一KpnI位点,构建含有该突变基因的质粒（骨架载体）,从而容纳嵌合体基因α亚基。PCR获得的嵌合体片断和骨架载体经NdeI/KpnI酶切后连接转化,约5000个转化子通过抑菌圈法（25mmol/L 7-ADCA,50 mmol/LD-PGA）初筛得到抑菌圈较大的嵌合体克降,共筛得约 400个克隆。 筛得的突变菌体经试管发酵,用HPLC分析,挑选合成与水解产物峰面积比对照（KcPGA）高2倍以上降进行进一步实验。通过测序,序列比对,分析嵌合情况,虽没有发现明显嵌合,但获得了包含突变以及与以往不同的类似亚基重组的克隆。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 综述
• 1.1 青霉素G酰化酶
• 1.2 青霉素G酰化酶在β－内酰胺类抗生素生物催化合成中的作用
• 1.2.1 1985年以前半合成β－内酰胺类抗生素工业生产
• 1.2.2 β－内酰胺类母核的生物催化合成
• 1.2.3 酶促侧链与β－内酰胺类母核的耦合
• 1.3 青霉素G酰化酶的水解与合成特性
• 1.4 固定化金属亲和层析
• 1.4.1 基本原理和步骤
• 1.4.2 基质
• 1.4.3 配位基
• 1.4.4 洗脱
• 1.5 蛋白质工程
• 1.5.1 有理设计
• 1.5.2 定向进化
• 1.5.3 获得定向进化多样性新方法之一——DNA混组技术
• 1.6 本研究的内容与目的
• 参考文献
• 第二章 四种野生型青霉素G酰化酶的克隆、表达、纯化与合成／水解比测定
• 2.1 引言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 仪器
• 2.2.2 质粒与菌种
• 2.2.3 培养基
• 2.2.4 酶和试剂
• 2.2.5 构建HisTag融合表达系统
• 2.2.6 发酵与表达
• 2.2.7 纯化
• 2.2.8 青霉素G酰化酶活性测定（NIPAB法）
• 2.2.9 PGA合成水解比（S／H）的测定
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 表达载体的构建
• 2.3.2 表达条件优化
• 2+-IDA agar亲和载体纯化效率'>2.3.3 Co²⁺-IDA agar亲和载体纯化效率
• 2.3.4 四种重组PGA的S／H值
• 2.3.5 结论
• 参考文献
• 第三章 青霉素G酰化酶DNA家族混组α亚基嵌合体库的建立及筛选
• 3.1 引言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 菌株和质粒
• 3.2.2 培养基
• 3.2.3 酶和化学试剂
• 3.2.4 引物设计与分子克隆
• 3.2.5 DNA家族混组中骨架基因的设计
• 3.2.6 五种PGA基因DNA家族混组
• 3.2.7 抑菌圈法筛选嵌合体克隆
• 3.2.8 重组克隆的小量发酵
• 3.2.9 HPLC高通量筛选重组克隆
• 3.2.10 大肠杆菌周质空间蛋白的小量快速抽提
• 3.2.11 PGA的活力测定（NIPAB法）
• 3.2.12 PGA合成水解比（S/H）的测定
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 多种PGA氨基酸序列联配和系统发育分析
• 3.3.2 DNA家族混组改造PGAα亚基
• 3.3.3 PGA基因嵌合库的抑菌圈法筛选
• 3.3.4 HPLC高通量筛选重组克隆效果
• 3.3.5 结语
• 参考文献
• 论文及专利
• 已发表论文
• 已申请专利
• 致谢