针药并用对脑出血大鼠急性期血肿周围脑组织细胞凋亡及相关基因表达的影响

论文摘要

目的:探讨脑出血（intracerebral hemorrhage,简称ICH）模型大鼠急性期血肿周围脑组织细胞凋亡及凋亡相关基因的变化规律,以及针药并用对细胞凋亡和凋亡相关基因的影响。方法:3月龄Sprague-Dawley（简称SD）雄性大鼠192只,体重250-300g,按随机数字表法随机分为空白对照组（简称空白组）8只,假手术组32只,ICH模型组（简称模型组）56只,单纯针刺组（简称针刺组）32只,单纯药物组（简称药物组）32只,针药并用组（简称针药组）32只。模型组随机分为6小时（hour,h）组、24h组、72h组、1周（week,w）组、2w组、3w组和4w组,每小组各8只。假手术组、针刺组、药物组和针药组分别再随机分6h组、24h组、72h组和1w组,每小组各8只。模型采用脑立体定位仪向SD大鼠右侧脑尾状核注入0.6U（0.2U/μl）胶原酶Ⅶ建立脑出血模型;假手术组向脑内注入3μl的生理盐水;空白组不手术。空白组、假手术组与模型组均不予治疗;针刺组给予针刺大鼠大椎、风府、水沟穴,每日1次。药物组给予麝香、冰片、粉防己灌胃,每日2次;针药组针刺治疗和药物治疗都进行,针刺时机、取穴、操作手法同针刺组,药物组成、浓度及灌胃时间同药物组。运用行为学、免疫组化学及病理学等方法,观察脑出血大鼠的神经功能缺损评分（neurological deficit score,NDS）、血肿周围脑组织细胞凋亡及相关基因在不同时点的变化规律及针刺、中药及针药并用对以上指标的影响。结果:1.针药并用能够改善ICH模型大鼠大鼠的神经功能模型组6h即出现神经功能缺损,神经功能缺损持续至48h,72h神经功能开始恢复。针刺组、药物组及针药组均在6h出现神经功能缺损,24h达到高峰,48h出现恢复,均较模型组神经功能恢复的时间点早。组间比较显示,模型组48h神经功能缺损较针刺组、药物组和针药组48h严重,差异具有显著性差异（P均＜0.05）。针刺组、药物组、针药组各个时间点的神经功能缺损评分未见显著性差异（P均＞0.05）。病死率方面,模型组死亡11只,针刺组死亡5只,药物组和针药组各死亡4只,且死亡多发生在48h内。模型组病死率为23.21%,针刺组为15.60%,药物组和针药组均为12.50%。采用x2检验发现,模型组、药物组、针刺组与针药组4组的病死率无显著性差异（P＞0.05）。本实验的结果显示,针刺组、药物组和针药组三组的神经功能恢复较模型组早,且缺损程度轻,说明三种治疗措施均能够改善ICH大鼠的神经功能,但不能降低ICH大鼠的病死率。2.ICH模型大鼠病理学改变光镜下可见模型组6h可见弥漫出血组织溶解;24h红细胞溶解,大量中性粒细胞浸润;72h血肿中心区可见红细胞大部分吸收,中性粒细胞浸润,可见淋巴细胞与单核细胞;1w血肿区中性粒细胞少,淋巴细胞增多,纤维结缔组织增生;2w后血肿基本吸收,血肿周围呈慢性炎症和纤维结缔组织增生。说明在脑出血后血肿周围确实存在炎症反应。3.针药并用能够减轻ICH模型大鼠急性期血肿周围脑组织细胞凋亡本研究用脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminaldeoxynucleotidyltransferase mediated d-UTP nick end labeling,TUNEL）标记凋亡细胞,结果显示:ICH后TUNEL阳性细胞的核呈紫蓝色或黑色着染,不规整,大小不一。ICH模型组6h开始出现黑色TUNEL阳性细胞,24h～72hTUNEL阳性细胞增多,且染色加深。统计学结果显示,模型组在6h开始出现TUNEL阳性细胞增多,24h急剧升高,到72h达到高峰,3w时仍明显高于正常。72h时TUNEL阳性细胞显著高于其他各个时间点（P均＜0.01）,2w至4w均显著低于其他各时间点（P均＜0.01）。正常组大鼠大脑皮质可见零星TUNEL阳性细胞,假手术组于针道周围有散在TUNEL阳性细胞。证明细胞凋亡参与了ICH后神经细胞的损伤过程。TUNEL阳性细胞大部分为神经元,少部分为星形胶质细胞及血管内皮细胞,这表明在出血性脑损伤中神经元最易受损,同时胶质细胞和内皮细胞亦受累。因此可以认为,细胞凋亡是出血灶周围脑组织损伤的一个标志,在一定程度上反映了其受损伤的程度。并且ICH后血肿周围炎症反应的高峰与细胞凋亡的高峰相一致,均在24h～72h,因此可以认为,ICH后炎症反应与细胞凋亡有关,炎症反应越严重,细胞凋亡越严重,脑组织损伤越严重。在针刺组、药物组和针药组,TUNEL阳性细胞的变化趋势虽与模型组相同,但针药组在24h～1w时的凋亡细胞数目均较模型组相应时间点显著下降（P＜0.05或0.01）;针刺组、药物组在6h、72h和1w时的凋亡细胞数目较模型组相应时间点显著下降（P＜0.01或0.05）。三个治疗组之间的比较显示,针刺组24h、72h和药物组72h凋亡细胞数目均较针药组相应时间点显著增多（P＜0.05或0.01）。说明针刺与药物治疗均可减轻细胞凋亡,而针药结合则效果更优于单一的针刺或药物。4.针药并用能够提高ICH大鼠急性期血肿周围bcl-2的表达,抑制bax的表达本研究应用免疫组化法标记bcl-2/bax,结果显示:bcl-2/bax阳性细胞的胞浆内或细胞膜上呈棕黄色细颗粒状,细胞核为浅蓝色,bcl-2和bax阳性细胞大部分为神经元。空白组有少量的淡黄色浅染的bcl-2和bax阳性细胞表达。模型组在24h～72h有多量黄色深染的bax阳性细胞表达,而有少量淡黄色浅染的bcl-2阳性细胞表达,1w后见多量黄染的bcl-2阳性细胞表达;三个治疗组bcl-2阳性细胞则在72h呈多量黄染。统计结果显示,ICH模型组bax呈现规律性表达,24h开始出现bax升高,72h达到高峰,1w时下降,2w至4w维持正常水平表达。模型组bcl-2在6h时略有升高,24h、72h又下降,1w时增多,持续至4w都为高表达。空白组与假手术组见少量的bcl-2和bax表达。bcl-2与bax阳性细胞多数为神经元,与TUNEL阳性细胞的类型吻合。直线相关性分析提示:bcl-2与bax呈负相关（r=-0.568,P＜0.01）,TUNEL阳性细胞数与bax的表达均呈正相关（r=0.415和0.662,P均＜0.01）,与bcl-2的表达呈负相关（r=-0.709,P＜0.01）,bax的高峰与TUNEL高峰相应。针刺组、药物组和针药组三组bcl-2表达均有增加,并都在72h时到达峰值。针刺组和药物组72h,针药组的24h、72h bcl-2阳性细胞表达显著高于模型组相应时间点的表达（P＜0.05）。三个治疗组之间的比较发现,针药组的24h、72h、1w时的bcl-2阳性细胞表达较针刺组相应时间点显著升高（P＜0.05或0.01）。针药组的所有时间点的bcl-2阳性细胞表达均显著高于药物组的相应时间的表达（P＜0.05或0.01）。针刺组6h bcl-2阳性细胞表达均显著高于药物组6h的表达（P＜0.05）。提示针刺、药物和针药并用均能够提高bcl-2的表达,以针药组更明显。针刺组、药物组和针药组未见模型组的bax表达高峰,各组各个时间点bax表达与空白组无显著性差异（P均＞0.05）,且各个组各相应时间点之间的bax表达无显著性差异（P均＞0.05）。针刺组72h、针药组72h bax阳性细胞表达较模型组72h bax表达显著降低（P＜0.05）。提示单纯的药物对bax的表达没有显著的影响,而针刺和针药组在一定程度上能够抑制bax的表达。5.针药并用能够抑制ICH模型大鼠急性期血肿周围caspase-3的表达本研究应用免疫组化法标记caspase-3,结果显示:空白组有少量的淡黄色caspase-3阳性细胞表达。caspase-3阳性细胞大部分为神经元。模型组caspase-3在6h-24h有多量黄色深染的阳性细胞表达。统计学结果发现,ICH后6h血肿周围组织即有caspase-3表达明显增加,持续至72h,后开始下降,1w时降至正常水平,3w时虽降至正常以下,但在4w时仍在正常水平,即caspase-3的表达早于凋亡的发生,且caspase-3阳性细胞多数为神经元,与TUNEL阳性细胞的类型吻合。TUNEL阳性细胞表达增多的高峰时程在24～72h,caspase-3阳性细胞表达高峰在6～72h。根据相关性分析提示,TUNEL阳性细胞数与caspase-3的表达均呈正相关（r=0.662,P＜0.01）。针刺组、药物组和针药组caspase-3阳性细胞变化趋势与模型组相同,但从72h开始即有回落,模型组、针刺组、药物组各时间点caspase-3阳性细胞表达相互比较无显著性差异（P＞0.05）。针药组6h、24h、72h caspase-3阳性细胞表达均显著低于模型组相应时间点的表达（P＜0.05或0.01）。针药组在24h时caspase-3阳性细胞显著低于药物组的表达（P＜0.05）。说明针药并用对caspase-3有明显的抑制作用。结论综述所述,在ICH急性期血肿周围存在着细胞凋亡,高峰时程在24～72h。与凋亡相关的促凋亡基因—bax与caspase-3分别出现高表达,且表达高峰分别在24h～72h和6h～72h。而凋亡抑制基因bcl-2则在6h出现短暂的高表达后下降,1w后才出现高表达。相关性分析提示,细胞凋亡与caspase-3和bax的表达均呈正相关,与bcl-2的表达呈负相关（P＜0.01）,且caspase-3表达在开始及高峰时间上均先于细胞凋亡的发生,bax的高峰与TUNEL高峰相应。单纯针刺治疗能够提高bcl-2的表达,抑制bax的表达,而单纯的药物治疗只能提高bcl-2的表达,而对bax和caspase-3则没有表现出抑制作用。针药组则能够提高bcl-2的表达,抑制bax和caspase-3的高表达,从而达到抑制细胞凋亡的目的。提示针药并用在抑制细胞凋亡方面效果优于单纯的针刺和药物。

论文目录

• 摘要
• 中文摘要
• Abstract
• 引言
• 第一部分 文献研究
• 第一节 出血中风的发展源流
• 1 中医学对中风病病名的认识
• 2 中医学对中风病病因病机的认识
• 3 中医学对中风病治疗的认识
• 第二节 细胞凋亡在脑出血中的研究进展
• 1 细胞凋亡参与出血性脑损伤
• 2 脑出血后细胞凋亡的机制
• 3 脑出血后细胞凋亡的防治策略
• 第三节 脑出血的中医治疗
• 1 中医药治疗脑出血的研究进展
• 2 针灸治疗ICH的临床与基础研究进展
• 参考文献
• 第二部分 实验部分
• 第一节 概述
• 1 脑出血模型的选择
• 2 针刺取穴
• 3 中药在脑出血急性期的应用
• 第二节 针药并用对脑出血模型大鼠急性期神经功能缺损的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第三节 针药并用对脑出血模型大鼠急性期血肿周围脑组织细胞凋亡及凋亡相关基因的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第三部分 结论
• 1 文献研究
• 2 实验研究
• 3 本研究的创新性
• 4 展望
• 参考文献
• 附录
• 附录一: 英文缩写词表（Abbreviations）
• 附录二: 图片
• 致谢