粉纹夜蛾抗Bt Cry1Ac毒素细胞与敏感细胞的差异蛋白质组学初步分析

论文摘要

自1957年美国太平洋酵母公司生产出第一个苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）商品制剂以来，Bt杀虫剂作为一种对人畜安全、无环境污染、产量高、效果好的微生物杀虫剂，在农、林及卫生害虫的防治中发挥了重要作用，成为国内外开发应用最成功的一种生物农药。但随着它的广泛使用和多种转Bt基因植物的推广，害虫已经对Bt产生了明显的抗药性，因此如何治理好昆虫对Bt的抗性已成为害虫防治中的重要问题。只有弄清楚昆虫抗性形成的分子机制，才能制定出合理的抗性管理策略，延缓抗性的产生。本实验室的前期工作已经证明了粉纹夜蛾离体培养的细胞能够对Bt杀虫晶体蛋白Cry1Ac产生一定水平的抗性，而且细胞系对Bt抗性特点与虫体的类似。因此本实验采用了对Bt Cry1Ac毒素十分敏感的BT1-TN-5B1细胞和同源的抗性细胞为实验材料，利用Cry1Ac毒素蛋白，经过连续的，高强度的抗性筛选，采用双向凝胶电泳和质谱联用技术，从蛋白质水平上来揭示两种细胞的差异。通过双向电泳技术，得到了粉纹夜蛾对Bt Cry1Ac抗性细胞和敏感细胞的总蛋白质电泳图谱，以ImageMaster Elite 5.0v软件来分析，发现Cry1Ac抗性细胞的总蛋白质点平均为896个，敏感细胞的总蛋白质点平均为838个。大部分蛋白分布在14-100KD之间，大部分蛋白的pI主要在4-9之间，酸性段和碱性段基本上没有分离到蛋白质点。挖取了细胞总蛋白图谱中几个重复性良好的蛋白质点，将这些点进行了肽质指纹图谱鉴定，通过通过Mascot检索蛋白质数据库，找到了几个可能与其有同源性的蛋白质，通过计算机软件的分析，在分值上和肽段的覆盖率上最为接近的一个蛋白质A为变形菌门γ-变形菌纲Idiomarina loihiensis L2TR的鞭毛驱动蛋白（flagellar motor protein），它与细菌质膜上的蛋白具有一定程度的同源性。表明该蛋白质可能是一种与细胞膜蛋白相似的蛋白。另外，对该点PMF的肽段分析发现该蛋白的1—44肽段与DNA甲酰氨基嘧啶—糖基化酶的肽段序列是完全匹配的，但要对其做出鉴定还需要进行N端测序来完成。蛋白质点B则没有找到与其匹配率较高的蛋白质。蛋白质点C则是与脂多糖生物合成蛋白具一定的同源性的蛋白质。这些蛋白可能与抗性的产生有直接或间接的关系。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• Ⅰ 研究背景
• 1 蛋白质组学概述
• 1.1 蛋白质组学定义
• 1.2 蛋白质组学中用到的研究手段
• 1.2.1 蛋白质的分离方法
• 1.2.2 蛋白质鉴定体系
• 1.2.3 蛋白质组学研究的应用
• 2 昆虫抗性机理的阐述
• 3 本研究的目的和意义
• Ⅱ 实验材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 昆虫细胞
• 2.1.2 大肠杆菌菌株
• 2.1.3 培养基的配制
• 2.1.4 溶液的配制
• 2.1.5 其他常用试剂
• 2.1.6 蛋白质分子量标准
• 2.1.7 实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 Cry1Ac 毒素晶体的表达
• 2.2.2 Cry1Ac 毒素的提取
• 2.2.3 昆虫细胞培养
• 2.2.4 Cry1Ac 毒素的纯化
• 2.2.5 Cry1Ac 毒素的鉴定
• 2.2.6 抗性细胞的获得（抗性筛选）
• 2.2.7 细胞总蛋白的提取
• 2.2.8 双向电泳
• 2.2.9 凝胶染色
• 2.2.10 蛋白质点的采集与分析
• 2.2.11 差异蛋白质点的肤质指纹质谱分析
• Ⅲ 实验结果与分析
• 3.1 Cry1Ac 毒素对昆虫细胞培养的影响
• 3.1.1 cry1Ac 毒素的鉴定
• 3.1.2 细胞的抗性筛选
• 3.2 双向电泳图谱及分析
• 3.3 PMF结果分析
• Ⅳ 讨论
• 4.1 讨论细胞总蛋白样品的制备对电泳效果的影响
• 4.2 根据 PMF 结果与数据库的信息比对的分析
• V 参考文献
• 附录: 聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶的配置
• 硕士期间完成的论文
• 致谢