岷江百合原生质体的分离与培养

论文摘要

原生质体培养及再生体系的建立在植物体细胞杂交、遗传转化及理论研究等方面具有重要的意义。岷江百合（Lilium regale Wilson）抗病性强,是重要的育种材料,可为体细胞杂交提供优良的亲本性状,其原生质体分离与培养的研究是体细胞杂交的前提。本文首先对岷江百合组培鳞茎诱导的两种愈伤组织的胚性进行鉴定,对其愈伤组织的状态进行调整,然后进行原生质体的分离与培养及其体系的优化。岷江百合两种愈伤组织的胚性鉴定结果如下：黄色愈伤组织为胚性愈伤组织,白色愈伤组织为非胚性愈伤组织。两者特征是：黄色愈伤组织外观形态上结构紧密,有光泽,质地硬,表面有许多光滑的球形突起,易剥离；其超微结构为细胞壁薄,排列紧密,细胞间隙很小,核大,质稠,细胞器较多,液泡很小而少。白色愈伤组织外观形态上结构疏松,湿软,没有光泽,表面没有突起；其超微结构为细胞壁厚,排列疏松,细胞间隙很大且排列不规则,细胞核小,液泡很大甚至充满整个细胞。以诱导的非胚性愈伤组织为试材,研究不同浓度的氯化钴及蔗糖对愈伤组织状态的影响。结果表明：高浓度的氯化钴（0.05 pμmol/L）和蔗糖（90g/L）有利于非胚性愈伤组织向胚性愈伤组织转变。氯化钻、蔗糖的浓度对岷江百合非胚性愈伤组织长势、增值系数、增殖体积的影响均达到显著性差异。较低浓度的氯化钴（0.01μmol/L）、蔗糖（30g/L）对愈伤组织的长势、增值系数及增值体积均有明显的促进作用,随着氯化钻和蔗糖浓度的增加,其长势、增值系数和增殖体积均有所降低。以悬浮细胞或愈伤组织为材料,运用酶解法制备原生质体。在酶解过程中研究酶液中的纤维素浓度、洗液中山梨醇浓度、酶解时间和酶解方式等因素对原生质体产量的影响。结果表明：山梨醇浓度和酶解时间对原生质体产量影响均有极显著性差异。山梨醇浓度为140g/L,酶解时间为6h时分离得到的原生质体产量最高,产量最高达7.17×105个/g,活力达到70.6%。纤维素酶浓度和酶解方式对原生质体产量的影响均未达显著水平。以制备的原生质体-酶混合液为试材,研究纯化过程中细胞筛目数、离心转速及时间对原生质体纯度的影响。结果如下：经目镜测微尺测量,岷江百合原生质体的直径大小为30-80μmm。180目是最适合岷江百合原生质体粗过滤的细胞筛目数。离心转速为300r/min,时间为4min或5min时原生质体的纯度最高。采用液体浅层培养法将纯化的原生质体进行培养,研究培养基的糖种类及浓度对原生质体分裂的影响。结果表明：葡萄糖比蔗糖更有利于原生质体的分裂,最佳浓度为60g/L。此时,原生质体分裂最早,分裂频率最高。培养2d后,原生质体便开始膨大变形,5d后原生质体发生第一次分裂,随后发生第二次分裂,10d后,分裂形成8～16个细胞组成的小细胞团。第一次分裂频率约为5%,细胞团形成频率约为2.5%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略表
• 1 前言
• 1.1 百合育种研究进展
• 1.1.1 百合简介
• 1.1.1.1 百合资源概况
• 1.1.1.2 百合特征及用途
• 1.1.1.3 百合的分类
• 1.1.2 岷江百合简介
• 1.1.3 百合育种研究进展
• 1.1.3.1 常规杂交育种
• 1.1.3.2 辐射育种
• 1.1.3.3 多倍体育种
• 1.1.3.4 分子育种
• 1.1.3.5 体细胞杂交
• 1.2 植物原生质体培养研究进展
• 1.2.1 原生质体培养研究的意义
• 1.2.2 原生质体培养概述
• 1.2.2.1 分离原生质体的材料
• 1.2.2.2 影响原生质体分离的因素
• 1.2.2.3 原生质体的纯化
• 1.2.2.4 原生质体的产量与活力测定
• 1.2.2.5 影响原生质体培养的因素
• 1.2.3 植物原生质体培养研究进展
• 1.2.4 百合原生质体培养研究进展
• 1.2.5 植物愈伤组织状态调整的研究进展
• 1.3 研究目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 培养条件
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 胚性愈伤组织与非胚性愈伤组织的鉴别
• 2.2.2 愈伤组织状态调整
• 2.2.3 酶液的配制
• 2.2.4 原生质体的分离
• 2.2.5 原生质体的纯化
• 2.2.6 原生质体产量及活力的测定
• 2.2.7 原生质体的培养
• 2.2.8 数据统计分析
• 3 结果与分析
• 3.1 胚性愈伤组织与非胚性愈伤组织的鉴别
• 3.1.1 胚性及非胚性愈伤组织外部形态比较
• 3.1.2 胚性及非胚性愈伤组织超微结构比较
• 3.1.3 不同来源的百合愈伤组织外部形态及其超薄切片观察
• 3.2 愈伤组织状态调整
• 2对愈伤组织状态转变的影响'>3.2.1 CoCl₂对愈伤组织状态转变的影响
• 3.2.2 蔗糖对愈伤组织转变的影响
• 3.3 原生质体分离
• 3.3.1 原生质体的分离
• 3.3.2 原生质体分离纯化条件的优化
• 3.3.2.1 细胞筛目数的选择
• 3.3.2.2 离心转速的确定
• 3.3.2.3 离心时间的确定
• 3.3.2.4 山梨醇浓度对原生质体分离的影响
• 3.3.2.5 纤维素酶浓度对原生质体分离的影响
• 3.3.2.6 酶解时间对原生质体分离的影响
• 3.3.2.7 酶解方式对原生质体分离的影响
• 3.4 原生质体培养
• 3.4.1 原生质体的液体浅层培养
• 3.4.2 原生质体培养条件的优化
• 4 讨论
• 4.1 愈伤组织的状态鉴别与调整
• 4.1.1 胚性愈伤组织与非胚性愈伤组织的外部形态比较
• 4.1.2 胚性愈伤组织与非胚性愈伤组织的超微结构比较
• 4.1.3 愈伤组织状态的调整
• 4.2 原生质体的分离
• 4.2.1 细胞筛目数、离心转速及其时间的确定
• 4.2.2 原生质体分离条件的优化
• 4.2.3 原生质体产量测定方法的改进
• 4.3 原生质体的培养
• 4.3.1 糖种类及浓度对原生质体分裂的影响
• 4.3.2 原生质体再生
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介